蛋白膜覆盖含量：一个协议测试可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用在体外</em

摘要

测试是必不可少的蛋白质 - 蛋白质相互作用蛋白质功能的夹层。在这里，我们引入在体外蛋白质 - 蛋白质结合检测探头与可溶性蛋白的膜固定蛋白质。这个实验提供了一个可靠的方法来测试不溶性蛋白质在溶液中的蛋白质之间的相互作用。

摘要

验证不同的蛋白质之间的相互作用是至关重要的，为在分子水平上的生物学功能的调查。有几种方法， 在体外和体内 ，以评估蛋白结合，并应进行至少有两种方法，相互补充的缺点，以获得可靠的见解。

对于一个在体内实验中，双分子荧光互补（附设）检测最流行 ​​的，至少侵入的方法，使检测活细胞内蛋白质相互作用，以及识别细胞内^相互作用的蛋白质1,2的本地化。在这个实验中，测试蛋白质融合GFP或它的变种N -和C -末端非荧光半，两个融合蛋白汇聚由于测试的蛋白质“相互作用时，荧光信号是^重组 3-6 。因为它的信号很容易epifluorescence或共聚焦显微镜检测，附设已经成为一个强大的工具，在^活细胞3中蛋白质相互作用的研究细胞生物学家之间的选择。然而，这个实验中，有时会产生假阳性结果。例如，荧光信号可以安排尽可能远离对方因7纳米包装在一个小的亚细胞车厢关闭两个GFP片段重组，而由于特定的^相互作用 7 。

由于这些限制，从活细胞成像技术所取得的成果，应确认由一个独立的方法的基础上，检测蛋白质相互作用的原理不同。免疫共（联合IP）或谷胱甘肽转移酶（GST）的代表等，通常用于分析蛋白质相互作用，在体外Pull - down实验的替代方法。然而，IIN这些实验，然而，测试的蛋白质一定要容易溶于supportsused结合反应的缓冲区。因此，具体涉及一种不溶性蛋白质的相互作用，不能由这些技术进行评估。

在这里，我们说明了蛋白质膜覆盖结合试验，从而绕过这个困难的协议。在这种技术中，可以可靠地测试可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用，因为固定在膜基质的蛋白质之一。这种方法， 在体内实验，如附设结合，提供了一个可靠的方法，调查和定性可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用忠实。在这篇文章中，烟草花叶病毒（TMV）之间具有约束力的运动蛋白（MP），发挥多种功能，在病毒的细胞与^细胞之间的运输8-14，以及最近发现植物细胞interactor，烟草含有锚蛋白重复蛋白（ANK ^15），证明使用这种技术。

研究方案

1。表达和提取的蛋白质

1. 差异标记要为他们的检测测试的蛋白质。标签膜（ProIM）被固定在一个尺寸较大的标签（例如，消费税），非融合标签可以使用一个固定的阴性对照组（ProIMnc）的蛋白质。标签用于大型或一个小标签作为一种可溶性的探头（ProSOL）的蛋白质。保险丝相同的标记，以一个合适的阴性对照的可溶性蛋白（ProSOLnc），包括在互动中检测，以确认检测约束力的特异性。
2. 选择蛋白表达系统表达标记蛋白，即大肠杆菌大肠杆菌 ，杆状病毒等，根据潜在的翻译后修饰和蛋白质的产量的要求。
3. 从选择的有机体，使用SDS - PAGE电泳上样缓冲液（20％的甘油，4％SDS，20毫米的Tris - HCl，pH6.8）含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒（步骤1.2）中_提取 ProIM和ProIM NC。在室温为15分钟的保留细胞悬液，加入0.5％2 - 巯基乙醇和煮沸5分钟。
4. 从选择的有机体，使用标准^的协议16（步骤1.2）中提取_ProSOL和ProSOL NC。这些蛋白质应该很容易在结合缓冲液中的可溶性（2毫米EDTA，140毫米，10毫米氯化钠，pH值7.4的Tris - HCl，2毫米的数码地面电视服务，1％BSA，0.1％吐温20）的步骤4.1中使用。
5. 确定重组的蛋白质，如Bio - Rad公司蛋白测定试剂盒，使用一种标准的方法的浓度。 Bio - Rad公司蛋白检测试剂盒等。如果原油中提取，纯化的蛋白质，而不是，是用来检测，估计相应频段的光密度扫描SDS -聚丙烯酰胺凝胶染色用考马斯亮蓝R - 250和使用已知浓度的蛋白质，这种提取物的兴趣BSA的浓度作为参考。

2。固定在膜ProIM和ProIMnc

1. 解决两套提取，每个SDS -聚丙烯酰胺凝胶含有1微克ProIM和ProIM _NC根据标准协议^16。
2. 电泳后，转移地方凝胶在转移缓冲液100毫升（60毫米甘氨酸，10毫米三，0.0006％SDS，20％甲醇）中，轻轻摇动孵育在室温为20分钟。
3. Electrotransfer包含在凝胶中根据标准^协议 16至硝酸纤维素膜上的蛋白质。

3。膜结合的蛋白质重新折叠

1. electrotransfer后，孵育15分钟在15毫升的缓冲膜（30毫米的Tris - HCl pH7.4的0.05％吐温20），轻轻摇动，以去除残留的SDS。
2. 经过仔细排水，转移膜的变性缓冲（7米盐酸胍，2毫米EDTA，50毫米数码地面电视，50毫米的Tris - HCl pH值8.3）至25毫升。孵育2小时，在室温下轻轻摇动。 （注：在变性缓冲液孵育时，硝酸纤维素膜变得不透明）。孵育2小时，在室温下轻轻摇动。
3. 膜转移至25 ml的TBS（10毫米的Tris - HCl，150 mM氯化钠，pH值7.4），轻轻摇动孵育5分钟（注意：在此步骤中，膜恢复原有的白色）。
4. 膜转移至25毫升的结合缓冲液（见第1.2步），并在4℃，轻轻摇动孵育过夜另。

4。通过ProSOL探测的ProIM

1. 切成条状，既包含ProIM和ProIM _NC膜。
2. 稀释1-10微克或10毫升新鲜的结合缓冲液中，无论是ProSOL ProSOLnc准备的ProSOL和ProSOLnc杂交解决方案。膜转移到每个ProSOL或ProSOLnc杂交液和孵育1.5 h在室温轻轻摇动。
3. 取出膜杂交的解决方案，并在TBS电视台每15分钟冲洗三次。

5。可视化免疫印迹蛋白质相互作用

1. 座膜在室温下1小时与2.5％的脱脂奶粉TBST（10毫米的Tris - HCl，140 mM氯化钠，0.05％吐温20，pH值7.4）。在制造商建议的浓度在0.5％的脱脂奶粉TBST稀释的主要抗体（抗- strepII多克隆兔抗体）。
2. 堵塞膜放置在抗体溶液，在室温下1小时或一夜之间孵育4℃，轻轻摇动。
3. 在15分钟20毫升TBST冲洗膜，并两次在室温下轻轻摇动5分钟。
4. 稀释与辣根过氧化物酶（HRP）的制造商建议的浓度在0.5％的脱脂奶粉TBST标记的第二抗体（抗兔IgG抗体）。将在二级抗体的膜解决方案，并在室温下轻轻摇动1小时孵化。
5. 在15分钟20毫升TBST冲洗膜，并两次在室温下轻轻摇动5分钟。最后的TBS冲洗后，可视使用HRP化学发光底物（例如，Millipore公司的Immobilon西部发光辣根过氧化物酶底物）的蛋白 - 蛋白相互作用。
6. 探头与融合ProIM，通过适当的辅助步骤5.1至5.4的抗体标记抗体相同的膜。可视化ProIM和ProIMnc中所述的步骤5.5来验证身份的蛋白膜覆盖法（步骤5.5）中获得的频段。在大多数情况下，剥离是没有必要，因为这一步得到的信号是比从步骤5.5中获得的剩余信号强多了。

6。代表性的成果：

附设在烟草表皮细胞（图1A）ANK - MP的相互作用。由于MP是一种高度不溶性蛋白质，在细菌或植物中的表达时，蛋白膜覆盖法通过，以验证这种在体外的相互作用（图1B ）。蛋白提取物中含有1微克的GST - MP（ProIM）或者未熔化的商品及服务税（ProIM _NC）的SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜，由electrotransfer解决。当这些ProIMs探讨可溶性ANK strepII（ProSOL），GST - MP，但不是非融合商品及服务税，展出具有约束力（图1B，泳道1，2，比较泳道5，6）。此外，当同一组的ProIMs无关ProSOLnc，即标签strepII（NADH3 strepII） 拟南芥胞质 NADH激酶，没有约束力不遵守，探讨进一步证明ANK - MP相互作用的特异性（图1B，车道3，4）。

图1。烟草ANK特异性结合烟草花叶病毒在体内和体外的MP 。 （一）ANK - MP在生活附设检测烟草表皮细胞的相互作用。强YFP的信号重建时，MP和ANK，C端和N -端半YFP的，分别融合，在烟草表皮microbombardment其编码基因共表达。这附设信号在puncta积累在细胞外围，这是¹⁵胞间连丝的诊断。 （二）ANK - MP 在体外的相互作用检测蛋白膜覆盖检测。 15％SDS聚丙烯酰胺凝胶electrotransfer随后到硝酸纤维素膜，蛋白提取物中含有1微克的GST - MP（ProIM），或者未熔化的商品及服务税（ProIMnc）解决。 GST - MPProIM和GSTProIMnc孵育0.5微克/毫升ANK strepII（ProSOL），ANK约束力是通过探测与反strepII多克隆抗体的膜，抗兔IgG + M二级抗体偶联检测辣根过氧化物酶（泳道1和2）。无论是GST - MPProIM也不GSTProIMnc互动与融合strepII标签（ProSOLnc，泳道3和4），一个不相关的蛋白，拟南芥胞质NADH激酶。在这个实验中观察到的乐队的身份被确认通过探测与抗GST抗体（5和6车道）膜。变性缓冲处理，而不会被用缓冲液A洗涤，当膜的GST - MP绑定ANK丢失，而不明身份的GST - MP和消费税contining蛋白提取物中的蛋白质与ANK - strepII反应，表现出的重要性步骤3.1之前的变性过程（7和8）。

讨论

这种方法适用于检测蛋白质相互作用的蛋白质之间的组合，当至少有一个，其中的蛋白质很容易结合缓冲液中的可溶性，并成功地^应用到其他结合蛋白17,18。不能测试都是在这些条件下的不溶性蛋白质之间的iInteractions本议定书。

此外，ProIM成功复性检测的关键。漂洗后的electrotransfer在TBS的膜是关键的一步，因为残留的SDS损害变性/复性过程。

最后?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号
蛋白检测试剂盒	Bio - Rad公司	500-0001
蛋白酶抑制剂的鸡尾酒	西格玛	S8820
迷你PROTEAN系统	BIO - RAD	165-8000
半干免疫印迹SD electrotransfer系统	BIO - RAD	170-3940
抗兔IgG抗体与辣根过氧化物酶的共轭	金斯瑞	A00098
抗GST多克隆抗体	金斯瑞	A00097
抗- strepII	金斯瑞	A00626
BioTrace，NT硝化棉转印膜	帕尔科学	27377-000
的Immobilon西部发光辣根过氧化物酶底物	Millipore公司	WBKL S0 050