Proteine ​​di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine ​​solubili e insolubili In vitro</em

Riepilogo

Test interazione proteina-proteina è indispensabile per la dissezione di funzionalità delle proteine. Qui, introdurre un In vitro Proteina-proteina saggio vincolante per sondare una membrana-proteina immobilizzato con una proteina solubile. Questa analisi fornisce un metodo affidabile per verificare l'interazione tra una proteina insolubile e una proteina in soluzione.

Abstract

Convalida interazioni tra proteine ​​diverse è fondamentale per l'esame delle loro funzioni biologiche a livello molecolare. Ci sono diversi metodi, sia in vitro che in vivo, per valutare legame con le proteine, e almeno due metodi che integrano le carenze di ogni altro dovrebbe essere condotta di acquisire le conoscenze affidabili.

Per un test in vivo, la complementazione bimolecolare fluorescenza (BiFC) saggio rappresenta l'approccio più popolare e meno invasivo che permette di rilevare l'interazione proteina-proteina all'interno delle cellule viventi, così come individuare la localizzazione intracellulare del ^1,2 interagendo proteine. In questo saggio, non fluorescente metà N-e C-terminale della GFP o di sue varianti si fondono alle proteine ​​testate, e quando le due proteine ​​di fusione sono riuniti a causa delle interazioni delle proteine ​​testate ', il segnale fluorescente viene ricostituito ^3-6 . Perché il suo segnale è facilmente rilevabile mediante microscopia in epifluorescenza e confocale, BiFC è emersa come un potente strumento di scelta tra i biologi cellulari per lo studio di interazioni proteina-proteina nelle cellule viventi ^3. Questo test, tuttavia, possono a volte produrre risultati falsi positivi. Per esempio, il segnale fluorescente può essere ricostituito da due frammenti GFP disposte, per quanto 7 nm l'una dall'altra a causa di chiudere imballaggio in un piccolo vano subcellulare, piuttosto che a causa di interazioni specifiche ^7.

A causa di queste limitazioni, i risultati ottenuti dalle tecnologie di imaging cellulare dal vivo deve essere confermata da un approccio indipendente, basato su un principio diverso per rilevare le interazioni delle proteine. Co-immunoprecipitazione (Co-IP) o glutatione transferasi (GST) pull-down test rappresentano tali metodi alternativi che sono comunemente utilizzati per analizzare interazioni proteina-proteina in vitro. Tuttavia, iIn questi test, però, le proteine ​​testato deve essere facilmente solubile nel buffer che supportsused per la reazione di legame. Pertanto, le interazioni specifiche che coinvolgono una proteina insolubile che non può essere valutata da queste tecniche.

Qui, ci illustrano il protocollo per il saggio sovrapposizione proteina di membrana vincolante, che aggira questa difficoltà. In questa tecnica, l'interazione tra proteine ​​solubili e insolubili in modo attendibile testato perché una delle proteine ​​è immobilizzato su una matrice di membrana. Questo metodo, in combinazione con esperimenti in vivo, come BiFC, fornisce un approccio affidabile per studiare e caratterizzare le interazioni tra fedelmente proteine ​​solubili e insolubili. In questo articolo, vincolante tra virus del mosaico del tabacco (TMV) proteina movimento (MP), che esercita funzioni multiple durante virale cellula-cellula trasporto ^8-14, e un impianto di Interactor recentemente identificato cellulari, tabacco ankyrin ripetuta contenenti proteine ​​(ANK ) ^15, si dimostra con questa tecnica.

Protocollo

1. Espressione e l'estrazione delle proteine

1. Differenziale tag le proteine ​​da testare per la loro rilevazione. Etichetta la proteina di essere immobilizzato sulla membrana (ProIM) con un tag di dimensioni più grandi (ad esempio, GST), e il tag non condensato può essere utilizzato come controllo negativo immobilizzato (ProIMnc). Etichetta la proteina da usare come una sonda solubile (ProSol) sia con un grande o un tag di piccole dimensioni. Fusibile lo stesso tag di una proteina solubile appropriato controllo negativo (ProSOLnc) e includono nel test di interazione per confermare la specificità del legame rilevato.
2. Scegliere il sistema di espressione proteica di esprimere proteine ​​tag, vale a dire, E. coli, baculovirus, ecc, a seconda delle necessità di eventuali modifiche dopo traduzionali e le rese delle proteine.
3. Estratto ProIM e ProIM _nc dall'organismo di scelta (passo 1,2) con SDS-PAGE tampone di caricamento (20% glicerolo, 4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH6.8) contenente proteinasi cocktail di inibitori. Lascia la sospensione cellulare a temperatura ambiente per 15 minuti, aggiungere 0,5% di 2-mercaptoetanolo e fate bollire per 5 minuti.
4. Estratto ProSol e ProSol _nc dall'organismo di scelta (passo 1,2) utilizzando uno standard protocolli ^16. Queste proteine ​​dovrebbero essere facilmente solubile nel buffer di legame (140 mM NaCl, 10 mM, Tris-HCl pH 7.4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1% di BSA, 0.1% Tween 20) utilizzato nel passaggio 4.1.
5. Determinare la concentrazione delle proteine ​​ricombinanti utilizzando un metodo standard, come Bio-Rad kit di analisi delle proteine. come il Bio-Rad kit di analisi delle proteine. Se estratto grezzo, piuttosto che le proteine ​​purificate, viene utilizzato per l'analisi, stima la concentrazione della proteina di interesse in questo estratto attraverso la scansione densitometria della banda corrispondente su un SDS-poliacrilammide gel colorato con Coomassie Brilliant Blue R-250 e l'utilizzo di note concentrazioni di BSA come riferimento.

2. Immobilizzazione di ProIM e ProIMnc sulla membrana

1. Risolvere due serie di estratti, contenenti ciascuno 1 mg di ProIM e ProIM _nc su un SDS-poliacrilammide gel secondo il protocollo standard ^16.
2. Dopo l'elettroforesi, posto il trasferimento del gel in 100 ml di buffer di trasferimento (60 mM glicina, 10 mM Tris, 0,0006% SDS, 20% MeOH) e incubare con leggera agitazione per 20 minuti a temperatura ambiente.
3. Electrotransfer le proteine ​​contenute nel gel ad una membrana di nitrocellulosa secondo il protocollo standard ^16.

3. Re-piegatura di proteine ​​di membrana

1. Dopo electrotransfer, incubare la membrana per 15 minuti in 15 ml di tampone A (30 mM Tris-HCl pH7.4, 0,05% Tween 20) e scuotendo con cautela per rimuovere residui di SDS.
2. Dopo aver svuotato con cura, trasferire la membrana a 25 ml di tampone di denaturazione (7 M guanidina, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl pH 8,3). e incubare per 2 ore a temperatura ambiente con agitazione. (Nota: La membrana di nitrocellulosa diventa opaco quando incubati nel buffer di denaturazione). e incubare per 2 ore a temperatura ambiente con agitazione.
3. Trasferire la membrana di 25 ml di TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) e incubare con leggera agitazione per 5 min (Nota: durante questa fase, la membrana riacquista il suo originario colore bianco).
4. Trasferire la membrana a 25 ml di tampone vincolanti (vedi punto 1.2) e incubare a 4 ° C con agitazione per il pernottamento.

4. Sondaggio della ProIM da ProSol

1. Tagliare la membrana in due strisce, entrambi contenenti ProIM e ProIM _nc.
2. Rendere le soluzioni di ibridazione ProSol e ProSOLnc diluendo la preparazione con mcg 1-10 di entrambi ProSol o ProSOLnc in 10 ml di tampone fresco vincolanti. Trasferire ciascuna membrana nella soluzione di ibridazione ProSol o ProSOLnc e incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente e scuotendo con cautela.
3. Rimuovere le membrane dalle soluzioni ibridazione e lavare tre volte per 15 minuti ciascuno in TBS.

5. Visualizzazione interazione proteina-proteina mediante immunoblotting

1. Blocco della membrana con 2,5% di latte scremato in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) per 1 ora a temperatura ambiente. Diluire l'anticorpo primario (anti-strepII anticorpo policlonale di coniglio) in 0,5% di latte scremato in TBST alla concentrazione consigliata dal produttore.
2. Posizionare le membrane bloccato nella soluzione di anticorpi, e incubate per 1 ora a temperatura ambiente o per la notte a 4 ° C con agitazione.
3. Sciacquare le membrane in 20 TBST ml per 15 minuti, e due volte per 5 minuti a temperatura ambiente con agitazione.
4. Diluire l'anticorpo secondario (anti-IgG di coniglio) coniugati con perossidasi di rafano (HRP) in 0,5% di latte scremato in TBST alla concentrazione consigliata dal produttore. Posizionare le membrane in anticorpo secondariosoluzione e incubare per 1 ora a temperatura ambiente e scuotendo con cautela.
5. Sciacquare le membrane in 20 TBST ml per 15 minuti, e due volte per 5 minuti a temperatura ambiente con agitazione. Dopo l'ultimo risciacquo con TBS, visualizzare le interazioni proteina-proteina utilizzando un substrato chemiluminescenza HRP (ad esempio, Millipore Immobilon occidentale chemiluminescente substrato HRP).
6. Sonda le membrane stesse con l'anticorpo primario per il tag fusa ProIM, seguita da l'anticorpo secondario appropriato, come descritto nei passaggi 5,1-5,4. Visualizza ProIM e ProIMnc come descritto al punto 5.5 per convalidare l'identità delle bande ottenute nel test di sovrapposizione proteina di membrana (punto 5.5). Nella maggior parte dei casi, stripping non è necessario, perché il segnale ottenuto da questo passaggio è molto più forte segnale di residui ottenuti a partire dal punto 5.5.

6. Rappresentante dei risultati:

L'ANK-MP interazione è stata osservata da BiFC nelle cellule epidermiche tabacco (Figura 1A). Poiché MP è una proteina altamente insolubile se espresso in batteri o nelle piante, analisi delle proteine ​​della membrana sovrapposizione è stato adottato per convalidare questa interazione in vitro (Figura 1B). Estratti proteici contenenti 1 mg di GST-MP (ProIM) o non condensato GST (ProIM _nc) sono stati risolti mediante SDS-poliacrilammide gel elettroforesi, seguita da electrotransfer una membrana di nitrocellulosa. Quando questi sono stati sondati ProIMs solubile ANK-strepII (ProSol), GST-MP, ma non non condensato GST, esposti vincolante (Figura 1B, corsie 1, 2, confrontare corsie 5, 6). Inoltre, quando lo stesso insieme di ProIMs sono stati sondati con un ProSOLnc non correlate, cioè, Arabidopsis chinasi NADH citoplasmatico tag strepII (NADH3-strepII), non vincolante, non è stato osservato, dimostrando ulteriormente la specificità del ANK-MP interazione (Figura 1B, corsie 3, 4).

Figura 1. Legame specifico di tabacco ANK a TMV MP in vivo e in vitro. (A) ANK-MP interazione in vivo le cellule epidermiche tabacco come rilevato dal BiFC. Forte segnale YFP è stato ricostruito quando MP e ANK, fusa al C-terminale e N-terminale metà del YFP, rispettivamente, sono stati coespressi nell'epidermide tabacco seguenti microbombardment dei loro geni codifica. Questo segnale BiFC accumulata nel puncta alla periferia delle cellule, che sono diagnostici di plasmodesmi ^15. (B) ANK-MP interazione in vitro, come rilevato dal test di sovrapposizione della membrana proteica. Estratti proteici contenenti 1 mg di GST-MP (ProIM) o non condensato GST (ProIMnc) sono stati risolti in un 15% di SDS-poliacrilammide gel, seguita da electrotransfer su una membrana di nitrocellulosa. Il GST-MPProIM e GSTProIMnc sono stati incubati con 0,5 mg / ml di ANK-strepII (ProSol), e ANK legame è stato rilevato dal sondaggio della membrana con anticorpi anti-strepII anticorpo policlonale di coniglio, seguita da anti-coniglio di anticorpi IgG + M secondario coniugato a HRP (corsie 1 e 2). Né GST-MPProIM né GSTProIMnc interagito con una proteina non correlate, Arabidopsis chinasi citoplasmatica NADH, fusa al tag strepII (ProSOLnc, corsie 3 e 4). L'identità della band osservato in questa analisi è stata confermata dal sondaggio la membrana con anticorpi anti-GST (corsie 5 e 6). Quando la membrana è stata trattata con tampone di denaturazione senza essere lavati con tampone A, il legame della GST-MP per ANK è perso, mentre le proteine ​​non identificate contenute nel GST-MP e gli estratti proteici GST contining reagito con ANK-strepII, dimostrando l'importanza del passo 3,1 prima del processo di denaturazione (corsie 7 e 8).

Discussione

Questo approccio è adatto per testare interazioni proteina-proteina tra le combinazioni di proteine, quando almeno uno dei quali le proteine ​​è facilmente solubile nel buffer vincolante, ed è stato applicato con successo ad altra combinazione di proteine ^​​17,18. Il iInteractions tra le proteine ​​che sono sia insolubile in queste condizioni non possono essere testati da questo protocollo.

Inoltre, il successo di ripiegamento ProIM è fondamentale per l'analisi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
Proteine ​​test kit	Bio-Rad	500-0001
Inibitore della proteasi cocktail	SIGMA	S8820
Mini-PROTEAN sistema	Bio-Rad	165-8000
Semi-secco western blotting SD electrotransfer sistema	Bio-Rad	170-3940
Anti-IgG di coniglio coniugato con perossidasi di rafano	GenScript	A00098
Anti-GST coniglio anticorpo policlonale	GenScript	A00097
Anti-strepII	GenScript	A00626
Biotrace, NT nitrocellulosa membrana trasferimento	Pall scientifico	27377-000
Immobilon occidentale HRP substrato chemiluminescente	Millipore	WBKL S0 050