חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

Summary

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו מציגים במבחנה חלבונים assay מחייב בדיקה קרום משותקת חלבון עם חלבון מסיס. Assay זה מספק שיטה אמינה לבדיקת האינטראקציה בין חלבון מסיס לבין חלבון בתמיסה.

Abstract

אינטראקציות בין חלבונים שונים לאישור חיוני לחקירה של פונקציות הביולוגיים ברמה המולקולרית. ישנן מספר שיטות, הן במבחנה in vivo, כדי להעריך מחייב חלבון, לפחות שתי שיטות המשלימות את החסרונות של כל אחד אחר צריך להתנהל כדי להשיג תובנות אמין.

עבור assay ב vivo, השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) assay מייצג את הגישה הפופולרית ביותר פולשנית לפחות המאפשרת לזהות חלבונים אינטראקציה בתוך תאים חיים, כמו גם לזהות את לוקליזציה תאיים של ^1,2 החלבונים אינטראקציה. ב assay זה, אי - ניאון N-ו-C-מסוף חצאים של ה-GFP או גירסאותיה הם התמזגו חלבונים נבדק, וכאשר שני חלבונים היתוך הם הביאו יחד בשל אינטראקציות החלבונים "נבדק, האות ניאון הוא מחדש ^3-6 . בגלל האות שלו ניתן לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופיה epifluorescence או confocal, BiFC התפתחה ככלי רב עוצמה של בחירה בין ביולוגים התא ללימוד על חלבונים אינטראקציות בתאים חיים ^3. Assay עם זאת, לפעמים יכול להניב תוצאות חיוביות כוזבות. לדוגמה, האות ניאון ניתן מחדש על ידי שני שברים GFP מסודרים ככל 7 ננומטר אחד מהשני בגלל קרוב אריזה בתא subcellular קטן, אלא כי בשל אינטראקציות ספציפיות ^7.

בשל מגבלות אלה, התוצאות שהתקבלו טכנולוגיות הדמיה תא חי חייבת להיות מאושרת על ידי גישה עצמאית מבוססת על עיקרון שונה לאיתור אינטראקציות חלבון. Co-immunoprecipitation (Co-IP) או גלוטתיון transferase (GST) הנפתח מבחני מייצגים שיטות חלופיות כאלה משמשים בדרך כלל כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים במבחנה. עם זאת, אלה מבחני iIn, לעומת זאת, חלבונים נבדק חייב להיות מסיס בקלות למאגר כי supportsused עבור התגובה מחייב. לכן, אינטראקציות ספציפיות הקשורות חלבון מסיס לא ניתן להעריך על ידי טכניקות אלה.

כאן, אנו ממחישים את פרוטוקול עבור assay שכבת קרום חלבון מחייב, אשר עוקף את הקושי הזה. בטכניקה זו, האינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים ניתן לבדוק באופן מהימן כי אחד החלבונים היא משותקת על מטריצה ​​הממברנה. שיטה זו, בשילוב עם בניסויים vivo, כגון BiFC, מספק גישה אמינה לחקור ולאפיין בנאמנות אינטראקציות בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים. במאמר זה, מחייב בין נגיף פסיפס הטבק (TMV) חלבון תנועה (MP), אשר מפעילה פונקציות מרובות במהלך ההובלה התא אל התא ויראלי ^8-14, וכן interactor צמח זיהו לאחרונה הסלולר, טבק ankyrin לחזור המכילים חלבון (ANK ) ^15, מודגמת באמצעות טכניקה זו.

Protocol

1. הביטוי החילוץ של החלבונים

1. דיפרנציאלי לתייג את החלבונים להיבדק לגילוי שלהם. לייבל החלבון להיות משותקת על הממברנה (ProIM) עם תג בגודל גדול יותר (למשל, GST), ואת תג unfused יכול לשמש מלאה שלילי משותקת (ProIMnc). לייבל החלבון לשמש בדיקה מסיסים (ProSOL) עם או גדול או תג קטן. נתיך אותו תג לחלבון בקרה המתאימים שלילי מסיסים (ProSOLnc) ו לכלול assay את האינטראקציה כדי לאשר את הספציפיות של הכריכה זוהה.
2. בחר את ביטוי חלבון מערכת להביע את החלבונים המתויגים, כלומר, א coli, baculovirus, וכו ', בהתאם לדרישת שינויים שלאחר פוטנציאל התשואות translational של החלבונים.
3. תמצית ProIM ו ProIM _nc מן האורגניזם של בחירה (שלב 1.2) באמצעות SDS-PAGE חיץ טעינה (גליצרול 20%, 4% SDS, 20 מ"מ טריס-HCl, pH6.8) המכילה קוקטייל מעכב proteinase. השאירו את ההשעיה תא בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, להוסיף 0.5% mercaptoethanol-2 ו להרתיח במשך 5 דקות.
4. תמצית ProSOL ו ProSOL _nc מן האורגניזם של בחירה (שלב 1.2) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים ^16. חלבונים אלה צריכים להיות מסיסים בקלות למאגר מחייב (140 mM NaCl, 10 מ"מ, טריס-HCl pH 7.4, 2 mM EDTA, 2 מ"מ DTT, BSA 1%, 0.1% Tween 20) משמש בשלב 4.1.
5. קבע את ריכוז החלבונים רקומביננטי בשיטה סטנדרטית, כגון ערכת Bio-Rad assay חלבון. כגון ערכת Bio-Rad assay חלבון. אם לחלץ גולמי, ולא מטוהרים חלבון, המשמש assay, להעריך את ריכוז החלבון של עניין תמצית זו על ידי סריקת צפיפות של הלהקה המתאים מוכתם SDS-polyacrylamide ג'ל עם Coomassie מבריק כחול R-250 ושימוש ידוע ריכוזי BSA כנקודת התייחסות.

2. Immobilization של ProIM ו ProIMnc על הממברנה

1. פתרון שתי סדרות של תמציות, שכל אחד מהם מכיל 1 מיקרוגרם של ProIM ו ProIM _nc על ג'ל SDS-polyacrylamide לפי הפרוטוקול הסטנדרטי ^16.
2. לאחר אלקטרופורזה, במקום להעביר את הג'ל אל על 100 מ"ל של חיץ להעביר (60 mM גליצין, 10 mM טריס, 0.0006% SDS, MeOH 20%) דגירה עם תסיסה עדינה 20 דקות בטמפרטורת החדר.
3. Electrotransfer החלבונים הכלול הג'ל על קרום nitrocellulose לפי הפרוטוקול הסטנדרטי ^16.

3. Re-קיפול של הממברנה הנכנס חלבונים

1. לאחר electrotransfer, דגירה הממברנה במשך 15 דקות ב 15 מ"ל של החיץ (30 mM טריס-HCl pH7.4, 0.05% Tween 20) עם תסיסה עדינה להסיר SDS שיורית.
2. לאחר ייבוש בזהירות, כדי להעביר את הממברנה 25 מ"ל של חיץ denaturation (7 מ hydrochloride guanidine, 2 mM EDTA, 50 מ"מ DTT, 50 מ"מ טריס-HCl pH 8.3). ו דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. (הערה: קרום nitrocellulose הופך אטום כאשר מודגרות במאגר denaturation). ו דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
3. מעבירים את הממברנה כדי 25 מ"ל של כפות (10 mM טריס-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) ו דגירה עם תסיסה עדינה 5 דקות (הערה: במהלך שלב זה, הממברנה חוזר הצבע הלבן המקורי שלה).
4. מעבירים את הממברנה כדי 25 מ"ל של חיץ מחייב (ראה שלב 1.2) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה הלילה.

4. חיטוט ProIM ידי ProSOL

1. חותכים את הקרום לשתי רצועות, הן ProIM המכיל ProIM _nc.
2. הפוך את פתרונות הכלאה ProSOL ו ProSOLnc על ידי דילול הכנה עם 10-10 מיקרוגרם של ProSOL או ProSOLnc ב 10 מ"ל של חיץ מחייב טריים. העברת כל הממברנה לתוך הפתרון הכלאה ProSOL או ProSOLnc ו דגירה עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
3. הסר את הקרומים של פתרונות הכלאה ולשטוף שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד TBS.

5. חזותי חלבונים אינטראקציה ידי immunoblotting

1. חסום את הממברנה עם חלב רזה 2.5% ב TBST (10 mM טריס-HCl, 140 mM NaCl, 0.05 Tween 20%, pH 7.4) עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר. לדלל את הנוגדן הראשוני (אנטי strepII נוגדן ארנבת polyclonal) ב חלב רזה 0.5% ב TBST בריכוז המומלץ על ידי היצרן.
2. מניחים את הקרומים חסום בפתרון נוגדן, וטופחו על h 1 בטמפרטורת החדר או את הלילה בבית 4 ° C עם תסיסה עדינה.
3. שוטפים את ממברנות ב TBST 20 מ"ל במשך 15 דקות, ופעמיים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
4. לדלל את הנוגדן משני (אנטי נוגדנים IgG ארנבת) מצומדות עם peroxidase סוס צנון (HRP) ב חלב רזה 0.5% ב TBST בריכוז המומלץ על ידי היצרן. מניחים את הקרומים של נוגדן המשניפתרון דגירה עבור h 1 בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
5. שוטפים את ממברנות ב TBST 20 מ"ל במשך 15 דקות, ופעמיים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. לאחר השטיפה הסופית ב TBS, לחזות את האינטראקציה בין חלבונים באמצעות מצע chemiluminescence HRP (לדוגמה, Millipore Immobilon המערבי המצע chemiluminescent HRP).
6. בדיקה הממברנות אותו עם הנוגדן העיקרי עבור התג התמזגו ProIM, ואחריו נוגדן המשני המתאים כמתואר צעדים 5.1-5.4. דמיינו ProIM ו ProIMnc כמתואר צעד 5.5 כדי לאמת את זהותו של להקות שהושגו assay שכבת קרום חלבון (שלב 5.5). ברוב המקרים, הפשטת אין צורך, כי את האות המתקבל בשלב זה הוא הרבה יותר חזק האות המתקבל שיורית צעד 5.5.

6. נציג תוצאות:

האינטראקציה ANK-MP נצפתה על ידי BiFC בתאי טבק אפידרמיס (איור 1A). מכיוון MP הוא חלבון מסיס ביותר כאשר הביע בחיידקים או בצמחים, קרום חלבון assay כיסוי אומצה כדי לאמת את זה האינטראקציה במבחנה (איור 1B). תמציות חלבון המכיל 1 מיקרוגרם של GST-MP (ProIM) או unfused GST (ProIM _nc) נפתרו על ידי אלקטרופורזה בג'ל SDS-polyacrylamide, ואחריו electrotransfer אל קרום nitrocellulose. כאשר אלה ProIMs נבדקו עם מסיסים ANK-strepII (ProSOL), GST-MP, אבל GST לא unfused, הציג מחייב (איור 1B, מסלולים 1, 2, להשוות 5 נתיבים, 6). יתר על כן, כאשר את אותו סט של ProIMs נבדקו עם ProSOLnc שאינו קשור, כלומר NADH ארבידופסיס קינאז cytoplasmic מתויג strepII (NADH3-strepII), לא מחייב לא נצפתה, נוסף הממחיש את הספציפיות של אינטראקציה ANK-MP (איור 1B, נתיבים 3, 4).

באיור 1. מחייב ספציפיות של טבק ANK כדי TMV MP in vivo ו in vitro. (א) ANK-MP האינטראקציה בתאים חיים טבק אפידרמיס זוהה על ידי BiFC. סטרונג אות YFP שוחזר כאשר הפרלמנט ANK, התמזגו בטרמינל C-N-מסוף חצאי YFP, בהתאמה, היו coexpressed באפידרמיס טבק הבאים microbombardment של הגנים המקודדים שלהם. זה אות BiFC שנצבר puncta בשולי התא, אשר אבחון של plasmodesmata ^15. (ב) ANK-MP אינטראקציה במבחנה מזוהה על ידי חלבון הממברנה assay כיסוי. תמציות חלבון המכיל 1 מיקרוגרם של GST-MP (ProIM) או unfused GST (ProIMnc) נפתרו על ג'ל SDS-polyacrylamide 15%, ואחריו electrotransfer על קרום nitrocellulose. GST-MPProIM ו GSTProIMnc הודגרו עם 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ANK-strepII (ProSOL), ו ANK מחייב זוהה על ידי חיטוט הממברנה עם נוגדן אנטי strepII ארנב polyclonal, ואחריו נגד ארנב נוגדנים IgG M + משני מצומדות כדי HRP (מסלולים 1 ו -2). לא GST-MPProIM GSTProIMnc ולא תיקשר עם חלבון שאינו קשור, kinase ארבידופסיס cytoplasmic NADH, התמזגו תג strepII (ProSOLnc, נתיבים 3 ו 4). זהותו של הלהקה נצפתה assay זו אושרה על ידי חיטוט הממברנה עם נוגדן אנטי GST (נתיבי 5 ו - 6). כאשר קרום טופלה חיץ denaturation מבלי לשטוף עם חיץ, מחייב של GST-MP כדי ANK הולך לאיבוד, בעוד חלבונים מזוהה הכלול GST-MP ותמציות GST חלבון contining הגיבו ANK-strepII, הממחיש את חשיבות השלב 3.1 לפני תהליך denaturation (נתיבי 7 ו - 8).

Discussion

גישה זו מתאימה בדיקות חלבונים אינטראקציות בין שילובים של חלבונים, כאשר לפחות אחד מהם החלבונים הוא מסיס בקלות למאגר מחייב, והוא מיושם בהצלחה שילוב של חלבונים אחרים ^17,18. IInteractions בין חלבונים כי הן מסיס בתנאים אלה לא ניתן לבדוק על ידי פרוטוקול זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
Assay חלבון ערכת	Bio-Rad	500-0001
Proteinase קוקטייל מעכב	SIGMA	S8820
ה-Mini-פושט צורה ולובש צורה מערכת	ביו רד	165-8000
חצי יבש המערבי סופג SD מערכת electrotransfer	ביו רד	170-3940
נגד ארנב IgG מצומדות עם peroxidase צנון סוס נוגדן	GenScript	A00098
Anti-GST ארנב polyclonal נוגדן	GenScript	A00097
Anti-strepII	GenScript	A00626
BioTrace, העברת NT קרום nitrocellulose	מל מדעי	27377-000
Immobilon המערבי chemiluminescent המצע HRP	Millipore	WBKL S0 050