タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで</em

要約

テストのタンパク質 - タンパク質相互作用は、タンパク質の機能の解離のために不可欠である。ここでは、導入 in vitroでタンパク質 - タンパク質結合アッセイ。このアッセイは、不溶性タンパク質と溶液中のタンパク質間の相互作用をテストするために信頼性の高い方法を提供する。

要約

異なるタンパク質間の相互作用を検証することは、分子レベルでそれらの生物学的機能の研究に不可欠です。そこに結合タンパク質を評価するためのin vitroおよび in vivo の両方でいくつかの方法では、、であり、そしてお互いの欠点を補完少なくとも二つの方法は信頼性の高い洞察を得るために行われるべきである。

in vivoアッセイの場合は、二分子蛍光相補性（BiFC）アッセイは、生きた細胞内のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するだけでなく、相互作用するタンパク質の^1,2の細胞内局在を識別できる、最も人気があり、最も侵襲的なアプローチを表しています。このアッセイでは、非蛍光性のN -およびGFPまたはその変異体のC末端の半分がテストされたタンパク質に融合させ、そして2つの融合タンパク質が原因でテストタンパク質"相互作用するために一緒に持って来られる時、蛍光シグナルが^3-6を再構成する。その信号は、落射蛍光または共焦点顕微鏡によって容易に検出可能であるため、BiFCは、生きた細胞³のタンパク質間相互作用について研究するための細胞生物学者の間で選択の強力なツールとして登場しました。このアッセイは、しかし、時には偽陽性の結果を生成することができます。例えば、蛍光シグナルは限りお互いから7 nmが小さいため細胞内コンパートメントに梱包閉じるには、むしろそのため、特定の相互作用⁷のように配置された2つのGFPフラグメントによって再構成することができる。

これらの制限のため、生細胞イメージング技術から得られた結果は、タンパク質相互作用を検出するための別の原理に基づいて、独立したアプローチによって確認されるべきである。共免疫沈降法（共同IP）またはグルタチオントランスフェラーゼ（GST）プルダウンアッセイ一般的にin vitroでのタンパク質-タンパク質相互作用を分析するために使用されているような代替方法を表しています。しかし、これらのアッセイIIN、しかし、テストしたタンパク質は、結合反応のためにsupportsusedバッファーに容易に溶解する必要があります。したがって、不溶性のタンパク質が関与する特異的な相互作用は、これらの手法によって評価することができます。

ここで、我々はこの困難を回避する有効な蛋白質の膜のオーバーレイ結合アッセイ、プロトコルを示しています。タンパク質の一つが細胞膜のマトリックス上に固定化されているため、この手法では、水溶性と不溶性のタンパク質間の相互作用を確実にテストすることができます。このメソッドは、そのようなBiFCなどのin vivo実験、 のとの組み合わせで、水溶性と不溶性のタンパク質の間で忠実に相互作用を調査し、特徴付けるために信頼性の高いアプローチを提供します。この記事では、ウイルスの細胞間輸送^8-14、および最近同定された植物細胞の相互作用、タバコアンキリン反復を含むタンパク質（ANK中に複数の機能を発揮するタバコモザイクウイルス（TMV）移行タンパク質（MP）、の間の結合^）15は 、このテクニックを使用して示されています。

プロトコル

1。タンパク質の発現と抽出

1. 差彼らの検出をテストするタンパク質にタグを付ける。大きいサイズ（例えば、GST）のタグ付き膜（ProIM）上に固定化するタンパク質にラベルを付け、そして融合していないタグが固定されたネガティブコントロール（ProIMnc）として使用することができます。大規模または小規模なタグのいずれかを持つ水溶性プローブ​​（ProSOL）として使用するタンパク質にラベルを付けます。適切な陰性対照可溶性タンパク質（ProSOLnc）に同じタグを融合し、検出された結合の特異性を確認するために、相互作用のアッセイに含まれています。
2. すなわち、E.、タグ付きタンパク質を発現する蛋白質の発現系を選択します。 大腸菌 、バキュロウイルス、等、タンパク質の潜在的な翻訳後修飾と収量のための要件に応じて。
3. プロテイナーゼ阻害剤カクテルを含むSDS - PAGEローディングバッファー（20％グリセロール、4％SDS、20mMトリス- HCl、pH6.8）を用いて選択肢の生物（ステップ1.2）からProIMとProIM _ncを抽出する。 15分間室温で細胞懸濁液のまま、2 - メルカプトエタノールおよび5分間沸騰の0.5％を追加。
4. 標準プロトコル^16を使用^して選択肢の生物（ステップ1.2）からProSOLとProSOL _ncを抽出する。これらのタンパク質は、ステップ4.1で使用される結合バッファー（140mMのNaCl、10mMのトリス塩酸pH7.4の、2mMのEDTA、2mMのDTT、1％BSA、0.1％のTween 20）で容易に溶解する必要があります。
5. このようなバイオラッドのプロテインアッセイキットなどの標準的な方法を用いて組換えタンパク質の濃度を決定する。バイオラッドのプロテインアッセイキットなど。粗抽出物ではなく、タンパク質の精製は、アッセイに使用されている場合は、クマシーブリリアントブルーR - 250と、既知の使用に染色したSDS -ポリアクリルアミドゲル上の対応するバンドの密度測定をスキャンすることにより、この抽出物中の目的のタンパク質の濃度を推定リファレンスとしてBSAの濃度。

2。メンブレン上のProIMとProIMncの固定化

1. 抽出物の2セット標準プロトコル¹⁶に記載のSDS -ポリアクリルアミドゲル上ProIMとProIM _NC1μgを含む各を解決します。
2. 電気泳動後、転送バッファの100ml（60 mMグリシン、10mMのトリス、0.0006パーセントSDS、20％メタノール）で、転送のゲルを置き、室温で20分間穏やかに撹拌しながらインキュベートする。
3. 標準プロトコル¹⁶に記載のニトロセルロース膜にゲルに含まれるタンパク質をElectrotransfer。

3。膜結合タンパク質の再折りたたみ

1. electrotransferした後、バッファー15ml中に15分間メンブレンをインキュベート（30 mMトリス- HCl pH7.4の、0.05％ツイーン20）残SDSを除去するために穏やかに振とうさせながら。
2. 慎重に排出した後、変性バッファー（7 Mグアニジン塩酸塩、2mMのEDTA、50mMのDTT、50mMのTris - HCl pH8.3）を25mlのに膜を転送する。と穏やかに撹拌しながら室温で2時間インキュベートする。 （注：変性バッファー中でインキュベートしたとき、ニトロセルロース膜が不透明になる）。と穏やかに撹拌しながら室温で2時間インキュベートする。
3. 25 TBSの液（10mMのTris - HCl、150mMのNaCl、pH7.4）に、5分間穏やかに振とうさせながらインキュベートする膜を転送する（注：このステップでは、膜は元の白い色を取り戻す）。
4. 結合バッファーの25mlにメンブレンを移し（ステップ1.2参照）、4℃でインキュベート一晩穏やかに撹拌しながらC。

4。 ProSOLでProIMをプロービング

1. 2つのストリップ、両方を含むProIMとProIM _NCに膜を切り取ります。
2. 新鮮な結合緩衝液10mlでProSOLまたはProSOLncどちら1-10μgの準備を希釈することによりProSOLとProSOLncハイブリダイゼーション溶液を加えます。 ProSOLまたはProSOLncハイブリダイゼーション溶液中にそれぞれの膜を転送し、穏やかに撹拌しながら室温で1.5時間インキュベートする。
3. ハイブリダイゼーション溶液から膜を削除し、TBSで各15分を3回すすいでください。

5。免疫ブロッティングによりタンパク質間相互作用の可視化

1. 室温で1時間TBSTでは2.5％スキムミルク（10mMトリス- HCl、140mMのNaCl、0.05％ツイーン20、pH7.4）でメンブレンをブロックする。メーカーが推奨する濃度でTBSTで0.5％スキムミルクで一次抗体（抗strepIIポリクローナルウサギ抗体）を希釈します。
2. 抗体溶液でブロックされた膜を配置し、4℃、室温で1時間または一晩インキュベート℃で穏やかに振とうさせながら。
3. 15分間、2回穏やかに撹拌しながら室温で5分間、20mlのTBSTで膜を洗浄します。
4. メーカーが推奨する濃度でTBSTで0.5％スキムミルクでホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）を結合させた二次抗体（抗ウサギIgG抗体）希釈します。二次抗体のメンブレンを置きソリューションと穏やかに撹拌しながら室温で1時間インキュベートする。
5. 15分間、2回穏やかに撹拌しながら室温で5分間、20mlのTBSTで膜を洗浄します。最終的には、TBSで洗浄後、HRPの化学発光基質（例えば、ミリポアイモビロン西部化学発光HRP基質）を用いて、タンパク質 - タンパク質相互作用を可視化する。
6. ステップ5.4から5.1で説明したように、適切な二次抗体が続くProIMに融合されたタグ用の一次抗体と同じ膜を、プローブ。視覚化ProIMとProIMncは、タンパク質の膜のオーバーレイアッセイ（ステップ5.5）で得られたバンドのアイデンティティを検証するためにステップ5.5で説明。この段階で得られた信号は、ステップ5.5から得られる残差信号よりもはるかに強力であるため、ほとんどの場合、ストリッピングは、必要ありません。

6。代表的な結果：

ANK - MPとの対話は、タバコ表皮細胞（図1A）にBiFCで観察された。 MPは、細菌や植物において発現する高度に不溶性のタンパク質であるため、タンパク質の膜のオーバーレイアッセイは 、in vitro（図1B） におけるこの相互作用を検証するために採択されました。 GST - MP（ProIM）または非融合GST（ProIM _NC）1μgを含むタンパク質抽出物は、ニトロセルロース膜にelectrotransfer続いて、SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。これらProIMsは、水溶性ANK - strepII（ProSOL）、GST - MPが、融合していないではないGSTでプローブ結合展示されたとき（図1B、レーン1、2、レーン5、6に比較して）。また、ProIMsの同じセットが無関係ProSOLnc、すなわち、strepII（NADH3 - strepII）タグ付けされたシロイヌナズナ細胞質 NADHキナーゼでプローブしたときに、バインディングが観察されていない、さらにANK - MPの相互作用（図1B、レーンの特異性を実証3、4）。

図1。in vivoおよび in vitro における TMV MPのタバコANKの特異的結合。 BiFCによって検出されたとしてタバコ表皮細胞を生体内に（A）ANK - MPとの対話。 MPとANKは、C末端とそれぞれYFPのN末端半分、に融合されたとき強いYFP信号が再構成され、それらのコードする遺伝子のmicrobombardment以下のタバコの表皮に共発現させた。プラスモデスム¹⁵の診断である細胞の周囲、で涙点に蓄積されたこのBiFC信号。 in vitroでの （B）ANK - MPの相互作用などの蛋白質の膜のオーバーレイアッセイによって検出。 GST - MP（ProIM）または非融合GST（ProIMnc）1μgを含むタンパク質抽出物は、ニトロセルロース膜上にelectrotransfer続いて15％SDS -ポリアクリルアミドゲル上で分離した。 GST - MPProIMとGSTProIMncはANK - strepII（ProSOL）0.5μg/ mlのと共にインキュベートし、ANKの結合は、への結合抗ウサギIgG + M二次抗体に続いて、抗strepIIウサギポリクローナル抗体と膜をプローブによって検出されたHRP（レーン1および2）。 GST - MPProIMもGSTProIMncどちらもstrepIIタグ（ProSOLnc、レーン3および4）に融合された無関係なタンパク質、 シロイヌナズナ細胞質NADHキナーゼと相互作用する。このアッセイにおいて観察されたバンドのアイデンティティは、抗GST抗体（レーン5および6）を持つ膜をプロービングにより確認された。 GST - MPおよびGST続きですタンパク質抽出物に含まれている正体不明の蛋白質が重要性を実証、ANK - strepIIと反応しながら膜を緩衝液で洗浄されることなく、変性バッファーで処理した場合、ANKにGST - MPの結合は、失われステップ3.1の前に、変性過程（レーン7および8）。

ディスカッション

このアプローチは、タンパク質の組み合わせの間のタンパク質-タンパク質相互作用をテストするのに適している、タンパク質の際に少なくとも一つは、結合バッファーに容易に可溶であり、成功したタンパク質^17,18の他の組み合わせに適用した。これらの条件下で両方に不溶であるタンパク質の間iInteractionsは、このプロトコルでテストすることはできません。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
タンパク質アッセイキット	Bio - Rad社	500-0001
プロテイナーゼ阻害剤カクテル	SIGMA	S8820
ミニプロティアンシステム	BIO - RAD	165-8000
セミドライウェスタンブロッティングSD electrotransferシステム	BIO - RAD	170-3940
西洋ワサビペルオキシダーゼと結合抗ウサギIgG抗体	GenScript	A00098
抗GSTウサギポリクローナル抗体	GenScript	A00097
アンチstrepII	GenScript	A00626
BioTrace、NTニトロセルロース転写膜	ポールサイエンティフィック	27377-000
イモビロン西部化学発光HRP基質	ミリポア	WBKL S0 050