有针对性的超声微泡销毁技术简介

摘要

超声针对性的微泡销毁（UTMD）可用于直接站点特定的生物活性分子的交付，包括基因治疗的靶器官，如心脏和肝脏超声， ^1-6。

摘要

UTMD，生物活性分子，如带负电荷的质粒DNA编码感兴趣的基因的载体，添加阳离子脂质微^泡造影剂7-9炮弹。在小鼠中，这些载体携带的微泡可静脉给药，或直接向心脏的左心室。在较大的动物，他们也可以通过冠状动脉导管注入。随后的交付，从流通到靶器官，发生在微泡的共振频率的声空化。这很可能是产生机械能在短暂的或有针对性的地区的¹⁰个微血管内皮细胞之间的孔隙形成的微气泡的破坏结果。由于这种sonoporation效应的结果，和跨内皮细胞的转染效率的提高，和转基因的编码向量存放到周围组织。质粒DNA留在流通迅速降解血液中的核酸交货的可能性，从而进一步降低非超声组织和高度特异性的靶器官转。

研究方案

1。微气泡的股票准备

1. 在10毫升的PBS混合1克葡萄糖200毫克1,2 - 二棕榈酰- SN -甘油-3 - 磷脂和50毫克1,2 - 二棕榈酰- SN -甘油-3 - 磷脂。
2. 在沸水浴20-30分钟中加热的混合物，吸管搅拌，每隔5分钟。
3. 该解决方案可以存储在4℃至6个月。

2。微泡的制备

1. 以250μL的准备微泡造影剂原液和孵化，在40 ° 15分钟。
2. 预热的微泡造影剂的解决方案，然后转移到1.5 mL微管含50μL的甘油。
3. 纯化的质粒DNA编码的表达式构造感兴趣的基因（Qiagen公司的内毒素MegaPrep试剂盒，QIAGEN，日耳曼，医学博士，在这个例子中纯化的最佳浓度4mg/ml）1-2毫克。 2.4）磷酸盐缓冲液加入到500μL的最终体积。内毒素Qiagen公司maxipreps使用，以及无菌PBS，以保证无菌。
4. 在微管中的空气是那么Octafluoropropane天然气取代。
5. 微管，然后动摇大力牙科混汞为20秒。
6. subnatant含有残留DNA和缓冲区，没有约束的微泡，然后小心取出，微气泡层是用无菌PBS洗涤三次删除独立的DNA，并置于冰之间的每个洗涤周期。我们通常达到30-40％的约束力的效率。所有试剂都是无菌和护理，以尽量减少污染。
7. 质粒DNA结合微泡，然后放在冰长达两个小时，直到使用。
8. subnatant从混合后，PBS洗涤的微管删除，可以被用来确定未结合DNA的浓度，同样的金额势必根据已知的初始浓度，在使用260nm波长，这种解决方案的光密度测量分光光度计。

3。设备校准

1. 第一次使用之前，1 MHz的空蚀传感器需要进行校准，以确保适当的机械指数和脉冲重复。一个submergible 1兆赫，为13mm，重点不突出传感器连接到一个20 MHz函数/任意波形发生器，通过一个功率放大器。
2. 该传感器被放置在一个装满水的塑料容器，在一个水听器，已通过电荷放大器连接到500 MHz示波器的直接目的。
3. 波形，频率，振幅，突发周期，和功率放大都可以进行修改，以获得正确的的占空比和机械指数的最佳气蚀的微泡。对于这个特殊的实验中，我们已校准系统，机械指数在1 MHz〜1.3。

4。微泡配送及UTMD

1. 微泡造影剂的交付和UTMD之前，C57BL / 6小鼠分别通过腹腔注射100mg/kg氯胺酮和为5mg/kg甲苯噻嗪麻醉。
2. 微气泡的交付是通过直接注射给药，静脉注射进入心脏的左心室或通过尾静脉插管。对于直接注入心脏，量高达100μL的质粒DNA加载微泡造影剂的解决方案是通过30号针插在超声波作用下的可视化前的^第 4肋间进入心脏的左心室注入。
3. 从左边的室间注射微泡的解决方案丸是用视觉超音速队的38 MHz的高频超声换能器放置在固定位置上的鼠标在长轴使用VisualSonics胸部“VEVO 2100成像系统的可视化。所有的注射器和针头是无菌的，投保最无菌的环境可能对这些注射。
4. 紧随注射，微气泡的破坏进行〜5分钟，第二，小尺寸的低频率为1.0 MHz传感器直接持有超过所需的器官，针对本地区的破坏。在这个例子中，超声是管理的肝脏在脉冲重复频率为1.0 MHz，机械指数相当于约1.3-1.5，100毫秒脉冲重复每20个周期内。另外，脉冲可门控鼠标心电图一阵超声3张，每4-6个心动周期（在本实验中未显示）。我们取得更大的转染效率与协议，使毛细血管床之间的阵阵超声气泡笔芯。

5。另类送货方法

我们选择了突出的室间注射，由于程序复杂，但在许多情况下，如长期输液的微泡，尾静脉，jection是首选方法。对于微泡交付的尾部静脉方法，鼠标麻醉方式相同。注射器含有质粒DNA结合微泡，是连接到一个27号针头/尾静脉导管。尾静脉导管插入远端三分之一的向左或向右，鼠标的尾部沿侧脉。是摆在输液泵，自动管理一个统一的解决方案预置量超过预设的时间内内含有微气泡的注射器。我们通常在3ml/hour率注入200 -300μL。

动物用

处理所有动物均按照有关国家和/或当地的动物福利机构定义在具有良好的动物实践，和所有动物的工作是适当的委员会批准（夏威夷机构动物护理和使用委员会大学，批准文号07-100 -3）。使用适当的麻醉（氯胺酮/ zylazine）和止痛药（布比卡因和丁丙诺啡），尽管不要求。

6。代表性的成果：

UTMD介导质粒DNA交付的有效性进行评估可以通过多种方法，取决于在构造，如编码的基因，但不限于在活体成像，B -半乳糖苷酶体外染色，和/或萤光素酶免疫组化。特别是，允许一个监控基因表达的存在和持续时间在一个发光的记者（荧光素酶）基因与质粒转染小鼠连续在体内生物发光成像。精诺真活体成像系统（IVIS）（卡尺生命科学，霍普金顿，马）是用于发光成像。图片通常采取UTMD介导转后的第一天所有小鼠和重复，每三到四天，直到发光基因的表达不再是系统（图1）通过视觉检测。要准备发光成像的小鼠，小鼠第一次收到的荧光素酶报告的IP注入探头的D -荧光素（卡尺生命科学版），然后麻醉〜3分钟后。 〜10分钟出发前的动物是摆在IVIS成像室和一个完整的人体图像扫描的D -荧光素底物的生物分布。在采集过程中，萤火虫荧光素酶/ D -荧光素的光化学反应发出的光子进行测量。图1也说明了类似IVIS肝脏发光成像以下UTMD，图2是一个epifluorescence（100X）转染肝的形象，使用抗荧光素酶抗体（Sigma - Aldrich公司）和AlexFluor - 568标记的二抗（Invitrogen公司） 。很清楚地看到，UTMD介导的肝转不仅影响了血管内皮细胞，但hepatocyes。

图1（一）负控制鼠标：精诺真/ IVIS心脏成像UTMD治疗的小鼠。质粒+ PBS心脏指示UTMD，（b）治疗鼠标：质粒+通过心脏的微泡指示UTMD，和（C）治疗鼠标UTMD质粒+由肝脏微泡指示。

图（一）2。肝脏免疫组织化学UTMD“（红色反荧光素酶）。质粒与没有UTMD，及（B）与UTMD质粒。共聚焦图像（100X）;细胞核DAPI染色蓝。

讨论

UTMD代表一个基因传递的新方法。作为一个平台技术，它可以与许多潜在的基因治疗策略相结合，提供无数时需要高度的组织特异性的生物活性分子。生物技术的主要限制是转染效率低。另一个重要的考虑是方便的靶器官超声，可显着减少干预骨或空气。该技术需要优化技术的基础上靶组织¹¹以及声学的一个基本的了解，以限制组织^损伤 11，提高工作效率。但是，它提供了一种廉?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂/设备名称	公司	目录编号	评论
1,2 - 二棕榈酰- SN -甘油-3 - 磷脂	Sigma - Aldrich公司	P - 5911	微泡造影剂的脂质外壳组件
1,2 - 二棕榈酰- SN -甘油-3 - 磷脂	Sigma - Aldrich公司	P - 3275	微泡造影剂的脂质外壳组件
葡萄糖	Sigma - Aldrich公司	G5400	认为稳定微泡
磷酸盐缓冲液	Sigma - Aldrich公司	P5368
甘油	Sigma - Aldrich公司	G5516	相信，以防止凝聚微泡
Octafluoropropane气体	公司Airgas	N / A	在临床应用中所用的惰性气体
VialMix牙科混汞	施贵宝	N / A
1 MHz时，为13mm，重点不突出传感器	奥林巴斯	A303S - SU
20 MHz函数/任意波形发生器	安捷伦	33220A
功率放大器	克罗恩-海特有限公司	型号7500
水听器	Brüel和克亚尔的	类型1803
电荷放大器	Brüel和克亚尔的	类型2634
500 MHz示波器	力科	9354L
2100 VisualSonics“VEVO 34兆赫传感器的成像系统	VisualSonics	2100
27G一英寸尾静脉导管	VisualSonics	N / A
精灵加输液泵	肯特科学	GENIE