Введение в Ультразвуковое Целевые микропузырьков Техника Уничтожение

Резюме

Ультразвуковое Целевые микропузырьков уничтожении (UTMD) может быть использован для прямого конкретным участкам доставки биологически активных молекул, включая терапевтические гены, чтобы органы-мишени доступным для УЗИ, таких как сердце и печень ^1-6.

Аннотация

В UTMD, биологически активных молекул, таких как отрицательно заряженные плазмидных векторов ДНК, кодирующей ген интерес, добавляют в катионной липидной оболочки микропузырьков контрастных агентов ^7-9. У мышей, эти вектора несущих микропузырьков можно вводить внутривенно или непосредственно в левый желудочек сердца. В более крупных животных они могут также вводиться через внутрикоронарного катетер. Последующей доставки из обращения к органу-мишени происходит при акустической кавитации на резонансной частоте микропузырьков. Вполне вероятно, что механическая энергия, генерируемая микропузырьков разрушение влечет переходные образования пор в или между эндотелиальных клеток микроциркуляторного русла в целевом регионе ^10. В результате этого sonoporation эффект, эффективность трансфекции в и через эндотелиальные клетки усиливается, и трансгенных-кодирования векторов вещества поступают в окружающие ткани. ДНК плазмиды, оставшихся в обращении, быстро разлагается под нуклеаз в крови, что еще больше снижает вероятность доставки без ультразвуком тканей и приводит к весьма конкретным органом-мишенью трансфекции.

протокол

1. Микропузырьков массоподготовки

1. В 10 мл PBS смесь 200 мг 1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-фосфатидилхолин и 50 мг 1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина с 1 г глюкозы.
2. Нагрейте смесь в кипящую водяную баню на 20-30 минут, пипетки смешивания каждые 5 минут.
3. Раствор можно хранить при температуре 4 ° С не более 6 месяцев.

2. Подготовка микропузырьков

1. Возьмите 250 мкл подготовленного микропузырьков маточного раствора и инкубировать при температуре 40 ° С в течение 15 минут.
2. Подогретого микропузырьков раствор затем переведен в 1,5 мл микропробирок, содержащую 50 мкл глицерина.
3. 1-2 мг очищенной плазмиды ДНК, кодирующей выражение построить для интересующего гена (очищенная в этом примере Qiagen эндотоксина свободной MegaPrep комплекта Qiagen, Germantown, MD, с оптимальной концентрации 4mg/ml). 2,4) фосфат-солевой буфер добавляется конечного объема 500 мкл. Эндотоксина свободной Qiagen maxipreps используются, а также стерильных PBS, чтобы обеспечить стерильность.
4. Воздух в микропробирку затем заменили октафторпропана газа.
5. Микропробирку затем энергично потряс в стоматологической смеситель на 20 секунд.
6. Subnatant, содержащих остаточные ДНК и буфер, который не связан с микропузырьков затем тщательно удалены и микропузырьков слой промывают три раза стерильной PBS для удаления одиноких ДНК, и помещают на лед между каждой стирки. Как правило, мы достичь обязательным эффективностью 30-40%. Все реагенты являются стерильными и помощь для минимизации загрязнения.
7. Плазмиды ДНК-связанных микропузырьков затем помещаются на льду в течение двух часов до использования.
8. Subnatant удален из микропробирок после смешивания и PBS моет, может быть использован для определения концентрации несвязанного ДНК, а также суммы связаны основан на известной начальной концентрации, измеряя оптическую плотность этого раствора на длине волны 260nm использованием спектрофотометр.

3. Оборудование калибровки

1. Перед первым использованием 1 МГц кавитации преобразователя должна быть очень высокой, чтобы обеспечить надлежащую механическую индекса и повторения импульсов. Погружных 1 МГц, 13 мм, не сфокусировано датчик подключен к 20 МГц Функция / Генератор сигналов произвольной формы через усилитель мощности.
2. Датчик помещен в пластиковый контейнер с водой, направленные непосредственно на гидрофон, которая была связана с тактовой частотой 500 МГц осциллограф с помощью усилителя заряда.
3. Форма волны, частоты, амплитуды, ворвались цикла и усиления мощности могут быть изменены, чтобы получить правильный цикл и механических индекс оптимальным cavitate микропузырьков. Для данного эксперимента, мы калиброванный системы механического индекса эквивалентно ~ 1,3 на 1 МГц.

4. Микропузырьков Доставка и UTMD

1. До микропузырьков доставки и UTMD, C57BL / 6 мышей анестезировали 100mg/kg кетамин и 5mg/kg ксилазина через IP-инъекции.
2. Микропузырьков доставки вводили внутривенно через непосредственный впрыск в левый желудочек сердца или через хвост катетеризации вены. Для прямого сердечных инъекций, объемом до 100 мкл ДНК плазмиды загружены микропузырьков решение вводится через 30 иглы вставляются на переднем ^4-м межреберье по ультразвуковой визуализации в левый желудочек сердца.
3. Микропузырьков болюсного решение в результате левый инъекции межжелудочковой визуализируется с помощью Visual Sonics '38 МГц высокой ультразвукового преобразователя частоты помещен в стационарное положение на грудной клетке мыши в длинной оси просматривать с помощью VisualSonics "Vevo 2100 Imaging System. Все шприцы и иглы стерильные, страхование самой стерильной среде возможным для этих инъекций.
4. Сразу же после инъекции микропузырьков уничтожение осуществляется за ~ 5 минут с помощью второго, меньшего размера низкой частоте 1,0 МГц преобразователь состоялась непосредственно на желаемый орган, ориентации уничтожения в этом регионе. В этом примере, ультразвук вводили печени при частоте повторения импульсов 1,0 МГц, механический эквивалент индекса примерно до 1,3-1,5, а пульс периодом повторения 100 мс на каждые 20 циклов. Кроме того, импульс может быть закрытых для ЭКГ мыши (не показаны в этом эксперименте), чтобы взрыв 3 кадра ультразвука, каждые 4-6 сердечных циклов. Получим большей эффективности трансфекции с протоколами, которые позволяют капиллярного русла пополнить с пузырьками между всплесками ультразвука.

5. Альтернативный метод доставки

Мы решили выделить межжелудочковой инъекции из-за сложности процедуры, но во многих случаях, таких, как длительное вливания микропузырьков, в хвостовую венупроекция является предпочтительным методом. Для хвостовой вены методом микропузырьков поставки, мышь под наркозом таким же образом. Шприц, содержащий плазмиды ДНК-связанных микропузырьков подключен к 27 иглы / хвостовую вену катетер. Хвостовую вену катетер вводится в дистальной трети правой или левой боковой вены, что наряду хвост мыши. Шприц, содержащий микропузырьков помещается в инфузионный насос, который автоматически управляет единый заданного объема раствора в течение заданного периода времени. Как правило, мы влить 200-300 мкл в размере 3ml/hour.

Животное использования

Все животные были обработаны в соответствии с надлежащей практикой животных, как это определено соответствующим национальным и / или местными органами защиты животных, и все животные работы был одобрен соответствующий комитет (Гавайский университет Институциональная уходу и использованию животных комитета, номер официального утверждения, 07-100 -3). Соответствующие анестезии (кетамин / zylazine) был использован и анальгетиками (Bupivicaine и бупренорфин) были доступны, хотя и не требуется.

6. Представитель Результаты:

Эффективность UTMD-опосредованной доставки ДНК плазмиды могут быть оценены с помощью различных методов в зависимости от генов, закодированных в конструкции, такие как, но не ограничиваясь ими; люциферазы в естественных изображений, B-гал исключая виво окрашивания и / или immunohistology. В частности, в естественных изображений биолюминесценции позволяет контролировать наличие и продолжительность экспрессии генов у мышей, серийно трансфицированных плазмидой, кодирующей биолюминесцентного гена-репортера (люциферазы). Xenogen В Vivo изображений (ИВИС) (суппорт Life Sciences, Хопкинтон, М. А.) используется для биолюминесцентного изображения. Изображения, как правило, приняты во всех мышей в первый день после UTMD опосредованной трансфекции и повторяется каждые три-четыре дня, пока биолюминесцентного экспрессии гена уже не визуально обнаружить с помощью системы (рис. 1). Для подготовки мышей для биолюминесцентного изображения, мышей сначала получить IP-инъекция люциферазы репортер зонда D-люциферин (суппорт науки о жизни), а затем под наркозом ~ 3 минут. Биораспределения Д-люциферин субстрата проводили в течение ~ 10 минут до животного помещается в ИВИС изображения камеры и полное сканирование изображения тела берется. Во время приобретения, фотонов, испускаемых из люциферазы светляков / D-люциферин фотохимические реакции измеряются. Рисунок 1 иллюстрирует также аналогичные ИВИС биолюминесцентного визуализации печени после UTMD, а на рисунке 2, epifluorescence (100X) образ трансфицированных печени с помощью анти-люциферазы первичных антител (Sigma-Aldrich) и AlexFluor-568 сопряженных вторичные антитела (Invitrogen) . Ясно видеть, что UTMD трансфекции печени опосредованный затронул не только эндотелиальные клетки, но hepatocyes также.

Рисунок 1 Xenogen / ИВИС изображений сердечной UTMD мышей () Отрицательное управление мышью:.. Плазмиды + PBS следуют сердечные направлены UTMD, (B) Лечение Мышь: плазмиды + микропузырьков затем сердечных направлены UTMD и (С) Лечение мышь : плазмиды микропузырьков + следуют печень направлены UTMD.

Рисунок 2. Immunohistochemistry печени UTMD (анти-люциферазы красным цветом). () Плазмида без каких-либо UTMD, и (Б) плазмиды с UTMD. Конфокальной изображение (100X); ядер DAPI окрашенных синим цветом.

Обсуждение

UTMD представляет собой новый подход к генной доставки. В качестве платформы технологии она может быть объединена ни с одним из многих возможных стратегий генной терапии, чтобы доставить множество биологически активных молекул при высокой степени тканевой специфичности желательно. Ос?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента / оборудование	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-фосфатидилхолин	Sigma-Aldrich	P-5911	компонентом липидной оболочки микропузырьков
1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина	Sigma-Aldrich	P-3275	компонентом липидной оболочки микропузырьков
глюкоза	Sigma-Aldrich	G5400	мысли по стабилизации микропузырьков
фосфатным буферным раствором	Sigma-Aldrich	P5368
глицерин	Sigma-Aldrich	G5516	Считается, чтобы предотвратить микропузырьков от сливающихся
Октафторпропана газа	Airgas	N / A	инертный газ, используемый в клинической практике
VialMix стоматологических смеситель	Bristol-Myers Squibb	N / A
1 МГц, 13 мм, не сфокусировано преобразователя	Олимп	A303S-SU
Функция 20 МГц / Генератор сигналов произвольной формы	Agilent	33220A
Усилитель мощности	Крона-Хайт Ко	Модель 7500
Гидрофон	Брюль и Къер	Тип 1803
Усилитель заряда	Брюль и Къер	Тип 2634
500 МГц осциллограф	LeCroy	9354L
Vevo VisualSonics »2100 Imaging System с 34 МГц датчик	VisualSonics	2100
27G один дюйм венозных катетеров хвост	VisualSonics	N / A
Genie Плюс инфузионного насоса	Кент Научные	GENIE