Introdução à Técnica Destruição Ultrasound Targeted microbolhas

Resumo

Destruição de ultra-som Targeted microbolhas (UTMD) pode ser usado para direcionar site-specific entrega de moléculas bioativas, incluindo genes terapêuticos, para órgãos-alvo acessível ao ultra-som, como o coração eo fígado ^06/01.

Resumo

Em UTMD, moléculas bioativas, tais como vetores de DNA carregados negativamente plasmídeo codificando um gene de interesse, são adicionados às conchas de lipídios catiônicos agentes de contraste de microbolhas ^7-9. Em camundongos essas microbolhas vetor carregando pode ser administrado por via intravenosa ou diretamente para o ventrículo esquerdo do coração. Em animais maiores também podem ser infundido através de um cateter intracoronário. A entrega posterior da circulação de um órgão-alvo ocorre por cavitação acústica em uma freqüência de ressonância de microbolhas. Parece provável que a energia mecânica gerada pelos resultados destruição das microbolhas na formação dos poros transitórios ou entre as células endoteliais da microvasculatura da região de destino ^10. Como resultado deste efeito sonoporação, a eficiência de transfecção em e através de células endoteliais é reforçada, e transgene codificação de vetores são depositados no tecido circundante. DNA plasmídeo restantes na circulação é rapidamente degradado por nucleases no sangue, o que reduz ainda mais a probabilidade de entrega para não-tecidos e sonicado leva a altamente específico transfecção de órgãos-alvo.

Protocolo

1. Preparação de microbolhas

1. Em 10 ml de PBS misturar 200 mg 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina e 50 mg 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina com 1 g de glicose.
2. Aqueça a mistura em ebulição água do banho de 20-30 minutos, pipetar mistura a cada 5 minutos.
3. A solução pode ser armazenada a 4 ° C por até 6 meses.

2. Preparação de microbolhas

1. Dê uma mL 250 da solução estoque preparada microbolhas e incubar a 40 ° C por 15 minutos.
2. A solução pré-aquecido microbolhas é então transferido para um microtubo 1,5 mL contendo 50 mL de glicerol.
3. 1-2 mg de DNA plasmidial purificado codificação de uma expressão construir para o gene de interesse (neste exemplo purificada por endotoxina Qiagen livre MegaPrep kit, Qiagen, Germantown, MD, com uma concentração ideal de 4mg/ml). 2.4) salina tamponada com fosfato é adicionado a um volume final de 500 mL. Maxipreps endotoxina livre Qiagen são usados, bem como PBS estéril, a fim de assegurar a esterilidade.
4. O ar no microtubo é então substituída por gás Octafluoropropane.
5. O microtubo é então agitada vigorosamente em um amalgamador dental por 20 segundos.
6. O DNA contendo subnatant residual e buffer que não tenha vinculado à microbolhas é então cuidadosamente removido ea camada de microbolhas é lavado três vezes com PBS estéril para remover DNA solto, e colocado no gelo entre cada ciclo de lavagem. Normalmente, alcancem uma eficiência de ligação de 30-40%. Todos os reagentes são estéreis e cuidados é feito para minimizar a contaminação.
7. O plasmídeo DNA-bound microbolhas são então colocados em gelo por até duas horas até o uso.
8. O subnatant removido do microtubo após a mistura ea PBS lavagens, pode ser usado para determinar a concentração de DNA não ligado, e também a quantidade limite baseado na concentração conhecida inicial, através da medição da densidade óptica da solução no comprimento de onda de 260nm utilizando um espectrofotômetro.

3. Calibração de equipamentos

1. Antes do primeiro uso, a um transdutor de cavitação MHz precisa ser calibrado para garantir índice mecânico adequado e de repetição de pulso. A submersível 1 MHz, transdutor, 13 milímetros unfocused está ligado a uma função de 20 MHz / Gerador de Formas de Onda Arbitrárias através de um amplificador de potência.
2. O transdutor é colocado em um recipiente de plástico cheio de água, voltado diretamente para um hidrofone, que tem estado ligado a um osciloscópio de 500 MHz através de um amplificador de carga.
3. Forma de onda, freqüência, amplitude, ciclo de burst, e amplificação de potência podem ser modificados para obter o ciclo de trabalho adequado e índice mecânico ideal para cavitar as microbolhas. Para este experimento em particular, temos calibrado o sistema para um índice mecânico equivalente a ~ 1,3 MHz a 1.

4. Entrega de microbolhas & UTMD

1. Antes da entrega de microbolhas e UTMD, camundongos C57BL / 6 foram anestesiados com quetamina e xilazina 100mg/kg 5mg/kg através de injeção IP.
2. Entrega de microbolhas foi administrado por via intravenosa através de uma injecção directa para o ventrículo esquerdo do coração ou por meio de cateterização da veia da cauda. Para a injeção direta cardíaca, um volume de até 100 l da solução de DNA-plasmídeo carregado de microbolhas é injetado através de uma agulha de calibre 30 inserido no espaço de 4 ^ª intercostal anterior sob visualização ultra-som para o ventrículo esquerdo do coração.
3. O bolus solução de microbolhas resultantes da injeção interventricular esquerdo é visualizado usando o Visual Sonics '38 MHz transdutor de ultra-som de alta freqüência colocado em uma posição estacionária sobre o tórax do mouse em uma visão de longo eixo usando VisualSonics "Vevo Imaging System 2100. Todas as seringas e agulhas são esterilizadas, garantindo o ambiente mais estéril possível para essas injeções.
4. Imediatamente após a injeção, a destruição das microbolhas é realizado para ~ 5 minutos, utilizando um segundo, menor tamanho de baixa freqüência 1,0 MHz transdutor realizada diretamente sobre o órgão desejado, visando a destruição desta região. Neste exemplo, o ultra-som foi administrado para o fígado em uma freqüência de repetição do pulso de 1,0 MHz, com um índice mecânico equivalente a cerca de 1,3-1,5 e período de repetição de pulso de 100 ms para cada 20 ciclos. Alternativamente, o pulso pode ser fechado para o ECG do mouse (não é mostrado neste experimento) para uma explosão de três quadros de ultra-som, a cada 4-6 ciclos cardíacos. Obtemos uma maior eficiência de transfecção com os protocolos que permitem que o leito capilar para reabastecer com bolhas entre rajadas de ultra-som.

5. Método de entrega alternativa

Optamos por destacar a injeção interventricular, devido à complexidade do procedimento, mas em muitos casos, como infusão prolongada de microbolhas, uma veia da cauda emprojecção é o método preferido. Para o método de cauda veia de entrega de microbolhas, o mouse é anestesiado do mesmo modo. A seringa contendo o plasmídeo DNA-bound microbolhas é conectado a um cateter da veia 27 gauge agulha / cauda. O cateter da veia da cauda é inserida no terço distal das veias ou direito ou lateral esquerdo, que ao longo da cauda do rato. A seringa contendo as microbolhas é colocado em uma bomba de infusão que, automaticamente, administra um volume uniforme predefinida de solução ao longo de um período de tempo predefinido. Normalmente, infundir 200-300 ul a uma taxa de 3ml/hour.

Uso de animais

Todos os animais foram tratados de acordo com a prática bom animal, tal como definido pelas autoridades nacionais e / ou órgãos de bem-estar animal local, e todo o trabalho animal foi aprovado pela comissão competente (University of Hawaii Animal Care Institucional e Comitê de uso, número de aprovação 07-100 -3). Anestesia adequada (ketamina / zylazine) foi usado e analgésicos (Bupivicaine e buprenorfina) estavam disponíveis, embora não seja necessário.

6. Resultados representativos:

A eficácia da entrega de DNA mediada por plasmídeo UTMD pode ser avaliado através de uma variedade de métodos, dependendo dos genes codificados na construção, tais como, mas não limitado a, luciferase in vivo de imagens, B-gal ex coloração vivo, e / ou imuno-histologia. Em particular, em imagem de bioluminescência vivo permite monitorar a presença e duração da expressão do gene em camundongos transfectados em série com um plasmídeo um gene repórter bioluminescentes (luciferase). O Xenogen In Vivo Imaging System (IVIS) (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) é usado para geração de imagens bioluminescente. As imagens são normalmente tomadas de todos os camundongos do primeiro dia após transfecção mediada UTMD e é repetida a cada 3-4 dias até a expressão do gene bioluminescentes não é mais visualmente detectável pelo sistema (Figura 1). Para preparar os ratos para imagens bioluminescentes, camundongos primeiro receber uma injeção IP do repórter luciferase sonda D-luciferina (Caliper Life Sciences) e são, então, anestesiados ~ 3 minutos depois. Biodistribuição do substrato D-luciferina é permitido prosseguir para ~ 10 minutos antes de o animal é colocado na imagem IVIS câmara e um exame de imagem de corpo inteiro é tomado. Durante a aquisição, os fótons emitidos a partir do luciferase do firefly / D-luciferina reação fotoquímica são medidos. A Figura 1 também ilustra imagem IVIS semelhante bioluminescentes do fígado após UTMD, e Figura 2 é uma imagem (100X) epifluorescência do fígado transfectadas com um anticorpo anti-luciferase primária (Sigma-Aldrich) e AlexFluor-568 anticorpo conjugado secundário (Invitrogen) . Está claro para ver que a transfecção mediada fígado UTMD tem afetado não só as células endoteliais, mas o hepatocyes também.

Figura 1 Xenogen / IVIS imagem de cardíaco UTMD camundongos tratados (A) Mouse Controle Negativo:.. Plasmid + PBS seguido por cardíaca dirigido UTMD, (B) Mouse Tratamento: Plasmid + Microbolhas seguido por cardíaca dirigido UTMD, e (C) Mouse Tratamento : Microbolhas + Plasmid seguido pelo fígado dirigida UTMD.

Figura 2. Imunohistoquímica do fígado UTMD (anti-luciferase em vermelho). (A) Plasmid sem UTMD, e (B) Plasmid com UTMD. Imagem confocal (100X); núcleos são DAPI azul manchado.

Discussão

UTMD representa uma nova abordagem para a entrega do gene. Como uma tecnologia de plataforma que pode ser combinado com qualquer uma das muitas estratégias de terapia potencial gene, para entregar uma miríade de moléculas bioativas quando um alto grau de especificidade do tecido é desejado. A principal limitação biológica da técnica é a baixa eficiência de transfecção. Outra consideração importante é a acessibilidade do órgão alvo ao ultra-som, que pode ser acentuada diminuição, intervindo osso ou ar....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / equipamentos	Companhia	Número de catálogo	Comentários
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina	Sigma-Aldrich	P-5911	componente do shell de lipídios microbolhas
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina	Sigma-Aldrich	P-3275	componente do shell de lipídios microbolhas
glicose	Sigma-Aldrich	G5400	pensamento para estabilizar as microbolhas
tampão fosfato	Sigma-Aldrich	P5368
glicerina	Sigma-Aldrich	G5516	Acredita-se evitar microbolhas de coalescência
Gás Octafluoropropane	Airgas	N / A	gás inerte utilizado em aplicações clínicas
Vialmix dental amalgamador	Bristol-Myers Squibb	N / A
1 MHz, transdutor, 13 milímetros unfocused	Olimpo	A303S-SU
Função 20 MHz / Gerador de Formas de Onda Arbitrárias	Agilent	33220A
Amplificador de potência	Krohn-Hite Co.	Modelo 7500
Hidrofone	Bruel e Kjaer	Tipo de 1803
Amplificador de carga	Bruel e Kjaer	Tipo de 2634
500 MHz Osciloscópio	LeCroy	9354L
Vevo VisualSonics "Imaging System 2100 com 34 MHz.	VisualSonics	2100
27G cateteres uma veia da cauda polegadas	VisualSonics	N / A
Genie Além disso bomba de infusão	Kent Scientific	GENIE