在子宫内电穿孔：鼠标控制时空基因Transefection

摘要

一个发展到小鼠大脑的基因转移方法是通过使用一个独特的手术方法和特殊形状的电极的描述。这种独特的技术使转染的​​质粒DNA的时间和空间，这将有助于研究脑的发育许多神经学家。

摘要

为了了解在发育中的大脑，包括信号分子和轴突导向分子，当地的基因转移或淘汰需要的特定区域基因表达的功能。基因靶向敲或淘汰到局部地区是可能的执行，结合特定的综合招聘考试线，这是费力，成本高昂，耗时。因此，一个简单的转染法，在子宫内电穿孔技术，可以用短的时间内执行，就会得心应手的测试可能的候选基因功能的转基因动物^的 1,2代前。此外，针对存在大脑里没有具体的综合招聘考试线在子宫内电领域，并会限制^胚胎杀伤力3,4。在这里，我们提出了一个在子宫内电到发育中的大脑目标领域相结合的两种不同类型的简单和方便的基因转移电极的方法。首先，使用胚胎光纤光缆光电缆的独特持有方法，将小胚胎（E9.5）进行有针对性的DNA注射入脑室的解决方案和针式电极插入到^目标的大脑区域5,6可见。 ，如大脑皮质区的图案出现在早期胚胎阶段，因此，这些早期从E9.5电作出了巨大贡献，了解整个地区的图案事件。其次，孔插入毛细管毛细血管的精确形状，防止子宫损伤。此外，钨和铂丝电极针的精确形状和削尖的使用砂纸，用^指甲油 7，这是非常详细的描述在这个协议的方法绝缘。这种独特的技术允许进入大脑禁区的质粒DNA转染，将使小胚胎被电。这将有助于工作在非常早期的萌芽阶段，细胞分化，细胞迁移，轴突导向的许多科学家打开一个新窗口。此外，这种技术将允许科学家质粒DNA转染到深部的丘脑和下丘脑的地方并不多，特定区域的综合招聘考试行增益功能（GOF）或丧失功能（LOF）分析存在的，如大脑发育。

研究方案

1。毛细血管和DNA注射液的制备

1. 纯化质粒DNA的一个最大的预习或等效的方法，使终浓度为2-3微克/μL。分装100微克的DNA，加上快速的绿色染料（1％的股份）和TE中加入10μl（10MM Tris碱，1mm的EDTA溶液，pH值8.0）和调整卷到100μL注射组合的最终DNA浓度为1μg/ μL。质粒DNA的浓度可以改变取决于质粒的大小，而且其转染效率，需要单独进行测试。
2. 5分钟旋转的DNA溶液在室温下14,000 RPM，并收集上清，以消除任何残留。
3. 拉玻璃毛细管tubea使用微量拉马的玻璃毛细管。用镊子夹断尖，使针尖直径为20-30微米。 800微米，1毫米，从尖端测量和检查外部直径小于60微米（ 图1A） 。
4. 将毛细管的显微操纵器，并填写与矿物油。为了填补毛细管DNA溶液，浸泡到溶液中的提示和吸DNA溶液。

2。垫条铂电极

在这里，我们用棒铂电极（NEPE基因，CUY611P2 - 1）electroporate到肤浅的大脑区域，如皮层（图1F），。

3。微电极的制备

使用微电极进入大脑（即，丘脑和下丘脑）（图2B - E），深部电穿孔。

1. 一端的钨（负极）和铂（正极）线盘绕镀金引脚和固定用封口膜。干棉签插入电线和包装两端封口膜（图1B）。
2. 均匀磨砺用砂纸线的一角，直到它到达外部直径20-30微米和60微米，800微米1毫米的提示（图1C和D）。
3. 应用波兰绝缘电线的指甲薄外套。指甲油干后，用丙酮浸泡棉签除去头（约200微米的尖端）。重要注意事项：为了防止破坏老鼠的子宫中，部分在800微米，1毫米的尖端直径应不超过70微米（图1E）。

4。手术的制备

1. 麻醉孕鼠（E9.5 - E15.5）。我们证明与医药级戊巴比妥钠麻醉（表二50微克每克体重，注入腹腔，并等待5分钟）。巴比妥钠作为麻醉剂的替代品，包括氯胺酮/甲苯​​噻嗪注射或气体麻醉药（气是可取的时间很短程序）。注入应注意做是为了避免任何机关，否则会造成损伤子宫或杀死动物。当成功的IP，成活率95％以上。此外，手术可在露天环境中进行。缺乏动物捏他们的脚趾，以确认麻醉前开始运作，测试。
2. 剃须头发从腹部用刀片和50％乙醇。准备与磨砂交替的优碘和酒精（70％）的皮肤。
3. 使用细剪刀腹正中线切口，拉出到37的所有子宫角仔细° C预预热的磷酸盐缓冲液（PBS）湿纱布，这是放置在伤口周围。保留子宫湿润，用PBS所有的时间。
4. 保持一个灵活的食指和中指之间的光缆和光纤放置在子宫角。清洁电缆与70％的乙醇，使用前。没有显微镜或放大镜是用于可视化的需要。光纤光光缆和拇指之间的位置子宫，并轻轻挤压，以推高接近胚胎在子宫壁上。

5。注射DNA和电

1. 当胚胎的位置，插入玻璃毛细管小心地将目标脑室注入约1μlDNA溶液（图2A）。
2. 对于电electoporation坚持铂电极使用的brainIf肤浅的一部分，子宫以外的地方的电极，并根据制造商的指示（见表一）申请提出方波电流脉冲。如果usingFor更深的大脑部分的电，nmicro电，eedle型电极使用。 Iinsert罚款钨成DNA的负电极注入子宫和两个电极之间发生的目标区域心室和铂电极，然后申请提出方波脉冲电流（见表一）（图2B）。

6。邮政电

1. 将其原价的子宫角回端子位置，并添加500 ° C预热的PBS 37μL。
2. 缝合手术缝合线和9毫米autoclipauto剪辑密切外层与内层。
3. 在2个小时的加热垫的动物，让从麻醉中复苏。如卡洛芬或丁丙诺啡镇痛药，可用于手术后疼痛管理。

7。代表性的成果：

pCAG - EYFP的皮质电的一些例子使用在不同的时间点坚持铂电极构造图图32所示。大脑电穿孔在E13.5，E14.5和E15.5，并在6日龄（P）的收获。 AThe ntibody RORC染色显示，4层的位置和EYFP的转染细胞位置绿色荧光抗体染色显示，两个图像超施加 （图3A和B ）。标记皮层细胞电穿孔的皮层细胞层显然是在每次实验（图32），这表明随时间变化的电皮质层的特定缆/ LOF可能的不同。

胚胎和细胞转染效率的可行性取决于胚胎的年龄和电的位置。样品表1所列，不过，条件应该是优化每个阶段，大脑的一部分取决于电。

进入深部组织，如丘脑和下丘脑使用棒铂电极的电穿孔经常给低效率（见表1）。通过使用微电极whichelectrodes，这将达到大脑深部，可以解决这个问题。图4显示pCAG EYFP到发展中国家间脑电的例子。质粒DNA溶液注入^第三脑室E11.5和微电（ 图 3C4C）。电穿孔面积限制在丘脑，其中大部分的轴突项目皮层（图3B4B） 。 EYFP，fillesfills整个神经元轴突投射到皮层的第4层，也可以显示。 （ 图 3A4A）。

图1展示的毛细血管的正确形状 。卡通示意图。 （A）玻璃毛细管拉使用微量拉马做出一定的形状。小费是由钳捏关闭，使其20-30微米。测量的提示（红色支架）800微米- 1MM，并确保外部直径小于60微米（绿色支架）。 （二）钨或白金线的一端是盘绕镀金引脚和封口膜固定。然后用砂纸，以使他们的尖端成为20-30微米的外部直径60微米和1毫米的尖端。 （三）钨丝之前塑造的形象。 （四）钨丝后塑造的形象。 （五）后申请的指甲油薄薄一层图像的钨丝。在E比例尺是10微米（最小刻度）为行政长官。 （六）坚持铂电极（NEPA基因。CUY611P2 - 1）。在F比例尺为2毫米。

图2。外科手术的卡通模式。 （一）图注入侧脑室或大的胚胎（左侧）， ^进入第三脑室或小胚胎（右侧） 。 （二）图electrporation铂棒电极（左侧）和针型电极（右侧）。

图3。电穿孔与发展鼠标端脑pCAG - EYFP E13.5（一），E14.5（B）和E15.5（C）和P6收获。大脑进行切片的日冕和分别与绿色荧光蛋白抗体或RORC抗体染色和图像合并。 （一）在E13.5转染许多第4层的神经元的电pCAG - EYFP的质粒。与第4层标记RORC重叠。 （二）在E14.5转染的细胞，这是更超过4层神经元表面的电pCAG - EYFP的质粒。 （三）E15.5电标签很多，如2 / 3层浅表神经元。比例尺200微米。

图4。EYFP转成丘脑-皮层的轴突（TCA） 。 （一）在皮质层4中的TCA总站发现绿色荧光抗体染色。 RORC抗体染色是用来揭示一个4层的位置。两个图像是取自同一节和合并。 （二）进入丘脑电的位置也显示绿色荧光抗体染色和RORC染色，这是在丘脑11限制。 （三）卡通丘脑电原理图和TCA投影显示。比例尺200微米。

讨论

在这个协议中，我们只描述成一个小胚胎大脑使用不同形状的电极禁区pCAG EYFP转技术的好处。对于不同的启动子转染效率的比较如前所述，这表明细胞类型^特异性 1 。不过，也有限制，如转染技术，只有短暂的变化取决于质粒，它不会有任何细胞特异性，这是难以控制转染细胞的数量。 ThereforeHowever此协议，与其他技术相结合，将进一步为不同的操作方法的可能性。首先，纳入细胞特异性启动子的质粒DNA，将使细胞类型，如神经元，神经胶质细胞和星形胶质细胞的特定的转染，。二，自染是短暂的，它是不适合那些希望在以后的生活中的基因的功能分析的科学家。因此，用转座质粒DNA整合到基因组的结合，将其转换成稳定^转染8。下一步，采用四面体或TET关闭系统将有可能操纵的时间或在⁸个神经细胞的细胞类型特异性基因表达。另外，可以结合他莫昔芬诱导的Cre - ER（T）的重组酶⁹和记者小鼠¹⁰本议定书。

这个组织的广泛的辅助，将彻底改变在神经科学中所使用的实验设计。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号
裸露的钨丝直径125微米	上午系统	797600
裸露的铂丝直径125微米	上午系统	767000
棒电极	NEPA基因	CUY610P4 - 1
玻璃毛细管	Stoelting	50611
显微	KD科学	KDS310
剪刀	ROBOZ	RS - 5865
脉冲发生器	上午系统	2100型
9毫米autoclip	ROBOZ	RS - 9260
镀金引脚	WPI	5482
RORC抗体	英仙座蛋白质组学	H3925