在极少数情况下，表皮转谷氨酰胺酶IgA和组织转谷氨酰胺酶2抗体的识别恒河猴皮炎

摘要

疱疹性皮炎（DH）是一种慢性炎症性IGA和表皮转谷氨酰胺酶（ETG）之间的自身免疫反应的条件。卫生署发展中的麸质敏感和/或腹腔的患者非常小的部分。这项研究的结果表明，卫生署也可以在idiopatic皮炎症状猕猴主机发展。

摘要

组织转谷氨酰胺酶2（tTG2）是肠道的消化酶deamidates已经部分消化的饮食面筋如醇溶蛋白肽。在遗传倾向的个体，tTG2触发自身免疫反应的特点是由生产tTG2抗体和直接沉积到小^肠壁 1,2 。这种抗体的存在，构成腹腔病（CD）的重要标志之一。表皮转谷氨酰胺酶（ETG），也可以作为在少数的CD患者的自身抗原的转谷氨酰胺酶家族的另一成员。在这些比较少见的情况下，ETG触发自身免疫反应（皮疹），临床上称为疱疹性皮炎（DH）。虽然CD和卫生署的发病的确切机制还不是很清楚，它是已知tTG2和血清抗体可以识别CD和卫生署^病人 3,4 ETG份额抗原表位。

猕猴 ）皮炎（表1，图1和2）皮损活检标本用于研究受影响的组织。在一个动物（EM96）IgA和tTG2抗体（图3）光谱重叠证明。集中在深的表皮，真皮​​乳头周围，存在的双阳性tTG2 + IGA +细胞。这是符合卫生署病人描述的^病变 3 。当EM96是一个无麸质饮食，皮炎，以及放置tTG2 + IGA +存款消失，不再检测到（图1-3）皮炎再现然而，基于EM96的饮食面筋（未显示）的重新引入。包括动物无关皮炎的其他猕猴，tTG2 + IGA +存款均未检出。无麸质饮食依赖性皮炎缓解EM96 tTG2存在+ IGA +在它的皮肤细胞表明自身免疫性疾病，卫生署状这种情况的发展机制。这是任何非人类灵长类动物中的DH -样皮炎的第一次报告。

研究方案

1。皮肤活检样品采集

1. 之前皮肤活检手术，麻醉动物肌注2.5毫克/公斤盐酸tiletamine zolazepam盐酸telazol的混合物（道奇堡动物健康，道奇堡，IA）。监控管理，直到斜卧麻醉的动物，然后删除其外壳。
2. 取下的头发和皮肤面积大小40刀片（奥斯特的专业产品，麦克明维尔，TN）利用奥斯特金A5单速兽医帆船利益无菌准备与优碘擦洗，酒精交替。一个在选定的活检部位的安全无菌孔的悬垂。
3. 使用无菌技术，一个4.0毫米Miltex打孔真皮活检仪器（Miltex，纽约，PA）对皮肤，同时旋转180度顺时针和逆时针轻微的压力的仪器，直到活检穿透真皮层断面进入皮下TIssue。取出活检样本和掌握钳和皮下组织的皮肤横断部分。
4. 一个十字图案附着在一个3 / 8圈切割针（Ethilon，爱惜康，强生公司医疗有限公司，伯克郡，英国）用3-0尼龙缝合关闭皮肤缺损。给所有的动物0.01毫克/千克手术后镇痛丁丙诺啡盐酸（Hospira公司，森林湖，IL）肌注。

2。样品处理

1. 恒河猴慢性皮炎和健康控制工作，从皮肤活检标本。获得两到三个（4毫米直径）活检从每个动物的样本。
2. 锌福尔马林（Z轴修复，Anatech有限公司，巴特尔克里克，心肌梗死），24小时修复第一个范例，在水冲洗30分钟，简单地在70％乙醇洗，并将其放置到ASP300徕卡组织处理器（莱卡微系统公司水牛城树丛，KS）组织脱水70％，80％，95％和100％的乙醇48升等级每分钟（费希尔科学，宾夕法尼亚州匹兹堡），其次是两个对二甲苯的变化（费舍尔）。
3. 长期储存在室温下嵌入石蜡媒体（费舍尔）。广场前20分钟到切片在20℃。准备用旋转切片机（HM325，MICROM国际，华尔道夫，德国）6微米的部分。广场路段收取的幻灯片（费舍尔）和空气干燥，60℃过夜。染色与苏木精和伊红（H＆E）的标准方法（如下所述）。
4. 修正了2％多聚甲醛（USB公司，克利夫兰，俄亥俄州）在室温下30分钟的第二个样本，在磷酸盐洗三次缓冲液（PBS，GIBCO Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州），在30％的蔗糖（费舍尔） 4小时，并嵌入在华侨城冻结介质（樱花Finetek，托伦斯，CA）。前20分钟到切片- 80℃保持。使用低温恒温器（HM560，Thermo Scientific的卡拉马祖，心肌梗死），准备15微米的部分。

3。 H＆E染色

1. Deparaffinize嵌入DED部分:通过三个转变二甲苯（费舍尔）和补充水分，通过分级ethanols三个转变为100％，95％的两个变化，一个变化的80％和蒸馏水，每2分钟。
2. 染色苏木（理查德艾伦科学，卡拉马祖MI）1分钟，并遵循一个简单的洗，在运行自来水。
3. （Sigma公司）与曙红染液为6分钟。
4. 通过95％和无水乙醇脱水染色组织，两个转变，每次2分钟，然后在三个变化对二甲苯明确，每3分钟。
5. 山玻璃罩使用Cytoseal安装介质（理查德 - 阿兰科学）在H＆E -染色组织切片。

4。病理组织学评价

检查H＆E -染色活检皮肤下的光显微镜使用4部分现货透视数码相机（数码仪器公司，美国密歇根州） - 40倍的放大倍率和徕卡显微镜。

5。免疫荧光STAI宁

1. OCT包埋免疫荧光染色的皮肤部分的工作。染色前，浸泡20分钟PBS中含0.1％，0.2％的鱼皮明胶（FSG，Sigma公司）TRITON X - 100（Sigma公司）删除华侨城通透组织。
2. 10％正常山羊血清（NGS，Sigma）的PBS - FSG稀释为1小时，在室温下，，孵育，洗涤后的幻灯片，在加湿的幻灯片室。
3. 为了形象化沉积的IgA和tTG2抗体，孵育反恒河猴IgA和tTG2初级抗体在10％农工商PBS - FSG稀释为1小时，幻灯片。
4. 洗10分钟，10分钟，PBS - FSG PBS - FSG - TRITON X - 100（Sigma公司）。
5. 孵育中学，同种特定标签的Alexa Fluor荧光488（绿色），568（红色）或633（蓝色）分子探针（Invitrogen公司）1:1,000稀释的抗体。使用TOPRO - 3染料可视化的核DNA。使用10％的农工商PBS - FSG作为抗体稀释液。
6. 使用反淬火液（Sigma公司），装入染色组织切片。

6。共焦成像

执行了Leica TCS SP2真正的共聚焦激光扫描显微镜配备了三个激光器（六行激发可用）（莱卡，韦茨拉尔，德国）成像:氩，氪激光波长为488（绿色），在568 nm的氪激光（红色）和在633 nm（蓝色），从可见光谱的远红方跨度的氦氖激光。记录微分干涉对比（DIC）的图像的非标记的组织架构进行评估。

7。代表性的成果

如图ETG tTG2和IgA抗体阳性确认的一个例子。 3A。在人类患者的情况，由于DH样皮炎的发病率要低得多，比CD般的面筋敏感性也恒河猴一致，皮肤活检标本大部分预计将SHOW的tTG2抗体阳性反应，但没有tTG2 + IGA +双（图4）阳性细胞的存在。这些卫生署无关的情况下，包括微生物来源皮炎的情况下，就会发现一些单积极IGA +散落下的上皮细胞，但tTG2和IgA标记的标记（图3B和4）之间的光谱重叠。因此，重要的是要保持建议的测试程序的顺序，与临床检查（图1）病理组织学评估（图2），只有在没有其他更常见的皮炎，造成代理商可以识别，焦，开始显微镜tTG2和IgA染色的皮肤切片检查是必要的。临床和/或组织病理学评估单是不足够的阳性诊断这种情况。在这种情况下，双阳性（tTG2 + IGA +）细胞真皮乳头周围区域确定，可以发出的DH -样皮炎诊断。在这种情况下，撤回饮食面筋和管理无麸质饮食的建议，以减轻皮炎症状。

图1。EM96猕猴前腹股沟区（A）和后（b）为5个星期的饮食面筋的撤离。重新饮食面筋正好与再现性皮炎（三）。

图2 HE染色EM96猕猴的皮肤活组织切片检查，收集前（A）和（二）撤销9个星期的饮食面筋。答:上皮增厚（7-15层上皮细胞）厚的角化细胞表面的地壳变质中性粒细胞浸润。中性粒细胞也出现上皮细胞内和中等数量的淋巴细胞，浆细胞，在真皮上层的附属器周围的组织细胞混合。乙:有些hyperkerat尘埃沉着病仍然存在，上皮厚度正常化（4-7层），以最小的淋巴浆细胞浸润在真皮上部。 C:FR56猕猴腹部皮肤正常，无淋巴浆细胞浸润，包括进行比较。放大倍数20倍。

图3。EM96猕猴的皮肤活组织切片检查前收集的共聚焦显微镜图像（A）和（二）撤销9个星期的饮食面筋。答:IGA染色（绿），tTG2（红色）和TOPRO - 3核DNA标记（蓝色）。 IgA和tTG2合作定位出现在周围的皮肤papilae面积的黄色。乙:皮肤样本9周后无麸质饮食显示，上皮细胞内没有IGA，​​而一些皮下IGA仍然存在（绿色），tTG2（红色）和TOPRO - 3核DNA标记（蓝色）。

图4。 GI24恒河猴皮肤活检共聚焦显微镜图像的收集，而动物是参展的慢性皮炎（DH -无关）症状。 IGA染色tTG2绿色，红色和TOPRO - 3核DNA标记是蓝色的。 tTG2 +细胞存在上皮细胞内，几个IGA +下方的上皮细胞，而没有广泛的光谱重叠的红色和绿色标记之间是可见的。

动物标签	性别 [男/女]	年龄 [年]	临床症状	等离子tTG2 抗体	饮食 [1,2] *
HJ71	F	1.3	健康	-	1
HD13	中号	1.4	健康，偶有腹泻	+	1
FR56	中号	5.4	慢性特发性腹泻	-	1
EM96	F	5.0	慢性皮炎	+ / - （边缘）	1和2
GI24	F	4.6	慢性皮炎	-	1

表1。TNPRC恒河猴用于收集皮肤活检

*饮食1 - 定期猴子议员（含麸质）;饮食2 - 无麸质饮食

讨论

最近，我们新成立的非人类灵长类动物模型面筋敏感性是用于研究饮食^面筋 5,6引发的肠道通透性变化。等离子体tTG2抗体以及肠道tTG2 + IGA +存款中检测到一些敏感的麸质的猕猴。由于我们最近认同在殖民地特发性皮炎的罕见事件恒河猴猕猴，这里没有通常的传染病/代谢的病因可能是成立，本研究的目的是，以评估如果tTG2 + IGA +抗体的存款可能被检测到的皮肤样本从这些罕见的情况下皮炎?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂或设备名称	公司	目录编号/产品编号	请注意
抗人IGA - FITC	Sigma公司，圣路易斯，密苏里州	F - 5259	1:100工作液
反人权tTG2	Thermo Scientific的卡拉马祖，心肌梗死	MS - 300 - P1ABX	1:100工作液
抗鼠IgG1 **	Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA	A - 21124	1:1,000工作液
TOPRO - 3 DNA探针***	Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA	T - 3605	1:1,000工作液
锌福尔马林 （Z - FIX）	Anatech有限公司，巴特尔克里克，MI	171
华侨城冻结 中等	樱花Finetek，托伦斯，CA	4583
Cytoseal安装 中等	理查德艾伦科学，卡拉马祖，心肌梗死	8312-4
反淬火 解决方案	Sigma公司，圣路易斯，密苏里州	P 3130
Ethilon （尼龙缝线）	爱惜康公司，强生公司，英国伯克郡，	663G
Miltex打孔真皮活检仪器	Miltex，纽约，PA	不适用
奥斯特金A5单速度与规模的40刀片兽医快船	奥斯特产品，麦克明维尔，TN	78005-050
徕卡组织处理器	莱卡微系统公司布法罗树丛，KS	ASP300
旋转式切片机	MICROM国际 华尔道夫，德国	HM325
低温恒温器	Thermo Scientific的， 卡拉马祖MI	HM560
共聚焦显微镜	莱卡，韦茨拉尔 德国	TCS SP2