Признание эпидермального трансглутаминазе по IgA и тканей трансглутаминазе 2 Антитела в редких случаях Резус Дерматит

Резюме

Герпетиформный дерматит (DH) является хроническим воспалительным состоянием, которое характеризуется аутоиммунной реакции между IgA и эпидермальный трансглутаминазе (ETG). DH развивается в очень небольшая часть глютен-чувствительная и / или целиакия пациентов. Результаты этого исследования показывают, что DH может также развиться в резус обезьяна хост с симптомами idiopatic дерматит.

Аннотация

Ткань трансглутаминазе 2 (tTG2) является кишечная пищеварительный фермент который deamidates уже частично переваренный диетические пептиды глиадина например, клейковины. В генетически предрасположенных лиц, tTG2 вызывает аутоиммунные реакции, которые характеризуются производство tTG2 антител и их прямое осаждение тонкого кишечника в ^1,2 стене. Наличие таких антител является одним из основных признаков целиакии (CD). Эпидермального трансглутаминазе (ETG) является еще одним членом семьи трансглутаминазе, что может также функционировать как аутоантиген в незначительное меньшинство CD пациентов. В этих довольно редких случаях, ETG запускает аутоиммунные реакции (кожная сыпь) клинически известно как дерматит герпетиформный (DH). Хотя точный механизм патогенеза CD и DH не очень хорошо понимал, как известно, что tTG2 и ETG доля антигенных эпитопов, которые могут быть признаны сывороточных антител с двух компакт-дисков и DH пациентов ^3,4.

(Macaca mulatta) с дерматитом (табл. 1, рис. 1 и 2) был использован для исследования пораженных тканей. У одного животного (EM96) спектрального перекрытия IgA и tTG2 антител (рис. 3) была продемонстрирована. Наличие двойной положительный tTG2 + IgA + клеток было сосредоточено в глубоких эпидермиса, вокруг кожных сосочков. Это согласуется с поражением описано у пациентов DH ^3. Когда EM96 был сделан на безглютеновой диете, дерматита, а также tTG2 + IgA + депозиты исчезли и больше не наблюдается (рис. 1-3). Дерматит появился однако, основаны на повторное введение пищевого глютена в EM96 (не показано). В других макак в том числе животных с несвязанными дерматит, tTG2 + IgA + депозиты не были обнаружены. Безглютеновой диеты зависит от прощения дерматита у EM96 вместе с наличием tTG2 + IgA + клеток в коже предлагают аутоиммунных, DH-какМеханизм развития этого состояния. Это первый доклад DH-как дерматит у любого не-человеческое приматов.

протокол

1. Биопсия кожи пробы

1. Перед процедурой биопсии кожи, обезболивания животных внутримышечно 2,5 мг / кг tiletamine гидрохлорид и zolazepam гидрохлорид telazol смеси (Fort Dodge Animal Health, Форт Додж, IA). Монитор животных от администрации анестезии до лежачее положение, а затем удалить из их корпуса.
2. Удаление волос с поверхности кожи сферу интересов использованием Остер Золотой A5 одной скорости ветеринарной Clipper с размером 40 лезвия (Остер Профессиональное оборудование, McMinnville, TN) и асептически подготовить с чередующимися скраб бетадин и алкоголь. Безопасные стерильной драпировки окончатый за выбранный сайт биопсии.
3. Использование стерильных, место 4,0 мм Miltex Удар Кожные инструментом биопсии (Miltex, Йорк, Пенсильвания) против кожи, одновременно вращая инструмент на 180 градусов по часовой стрелке и против часовой стрелки с легким нажатием до биопсии удар разрезов через кожные слои в подкожной тиСГУП. Удалить биоптата и понять пересекаются часть кожи пинцетом и свободной от подкожной клетчатки.
4. Закрыть дефект кожи с нейлоновыми 3-0 шва прилагается к 3 / 8 круга резки иглы (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson Medical Limited, Беркшир, Великобритания) в крестообразной шаблону. Дайте всех животных 0,01 мг / кг бупренорфин гидрохлорид (Hospira, Лейк-Форест, штат Иллинойс) внутримышечно в течение послеоперационного обезболивания.

2. Пример обработки

1. Работа с кожей биоптатов от хронического дерматита и контрольная группа здоровых людей резус-макак. Получить 2:58 (4 мм в диаметре) биопсии из каждого животного.
2. Fix первый образец в формалине цинка (Z-исправить, Anatech ООО, Battle Creek, Мичиган) в течение 24 часов, промыть в воде в течение 30 мин, смойте кратко в 70% этанола, и поместить в ASP300 Leica ткани процессор (Leica Microsystems, Inc , Buffalo Grove, KS), где ткань обезвоживается с восходящими сорта 70%, 80%, 95% и 100% этилового спирта 48мин каждый (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания), а затем два изменения ксилола (Fisher).
3. Добавить в парафин средства массовой информации (Fisher) для длительного хранения при комнатной температуре. Место на-20oC в течение 20 мин до секционирования. Подготовка разделов 6 мкм с помощью роторного микротома (HM325, Microm International, Вальдорф, Германия). Место разделы на заряженные слайды (Fisher) и сухой воздух при 60 ° С в течение ночи. Пятно гематоксилином и эозином (H & E) стандартным методом (см. ниже).
4. Fix второго образца в 2% параформальдегида (USB Corp, Кливленд, Огайо) в течение 30 мин при комнатной температуре, мыть три раза в фосфатном буферном растворе (PBS, Gibco-Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), место в 30% сахарозы (Fisher) для 4 часа, и внедрить в октябре замерзания среды (Сакура Finetek, Торренс, Калифорния). Хранить при температуре 80 ° С, в течение 20 мин до секционирования. Подготовка 15 мкм разделы, используя криостат (HM560, Thermo Scientific, Каламазу, Мичиган).

3. H & E окрашивания

1. Deparaffinize вставлятьДед разделах через три изменения ксилолов (Fisher) и увлажняет через градуированные ethanols: три изменения в 100%, два изменения в 95%, одно изменение на 80% и дистиллированной воды, 2 мин каждый.
2. Пятно гематоксилином (Richard Allan-научного, Каламазу, Мичиган) в течение одной минуты и следуйте путем краткого промыть в проточной воде.
3. Контрастирующая с эозином (Sigma) в течение 6 мин.
4. Дегидрировать окрашенных тканях через 95%, а абсолютный этанол, две перемены 2 мин каждый, и затем снимите в три смены ксилолов, 3 мин каждый.
5. Горы покровного стекла использованием Cytoseal Монтаж среднего (Richard Allan Научно-) по сравнению с H & E-окрашенных срезах ткани.

4. Гистопатологические оценки

Осмотрите H & E-окрашенных биопсии кожи разделы под световым микроскопом с помощью 4 - и 40-кратном увеличении микроскопа Leica SPOT Insight цифровой камеры (цифровой инструменты Inc, штат Мичиган, США).

5. Иммунофлуоресцентного СтаиNing

1. Работа с октября встраиваемый кожи разделы для иммунофлуоресцентного окрашивания. До окрашивания, замочить на 20 мин в PBS, содержащего 0,2% рыбьей кожи желатин (FSG, Sigma) с 0,1% Тритон Х-100 (Sigma), чтобы удалить октябре и permeabilize ткани.
2. После мытья слайды, инкубировать с 10% нормальной козьей сывороткой (NGS, Sigma), разведенного в PBS-ФСГ в течение 1 часа при комнатной температуре, во влажной камере слайд.
3. Для того, чтобы визуализировать отложение IgA и tTG2 антител, инкубировать слайды с анти-резус-IgA и tTG2 первичных антител, разведенного в 10% НГС-PBS-ФСГ в течение 1 часа.
4. Промыть PBS-ФСГ-Тритон Х-100 (Sigma) в течение 10 мин, после чего PBS-ФСГ в течение 10 мин.
5. Инкубируйте со средним, изотип-специфических антител с меткой Alexa Fluor флуорохромом 488 (зеленый), 568 (красный) или 633 (синий) (Molecular Probes-Invitrogen) на 1:1000 разбавления. Используйте ToPro-3 красителя для визуализации ядерной ДНК. Использование 10% НГС-PBS-FSG как антитело разбавителя.
6. Использование анти-закалки решение (Sigma) для монтирования окрашенных срезах ткани.

6. Конфокальной микроскопии

Выполните съемку с Leica TCS SP2 Правда конфокальной микроскопии лазерного сканирования (Leica, Wetzlar, Германия) оснащен тремя лазерами (шесть линий для возбуждения имеется): аргон-криптон лазер на 488 нм (зеленый), криптон лазер на 568 нм ( красный) и гелий-неонового лазера на длине волны 633 нм (синий), которые охватывают от видимого до дальнего красного сторону спектра. Запись дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображений для оценки без меток ткани архитектуры.

7. Представитель Результаты

Примером позитивного признания ETG как tTG2 и IgA антител, показан на рис. 3А. В соответствии с ситуацией в человеческом пациентов и из-за гораздо более низкую распространенность DH-как дерматит, чем CD-как клейковина чувствительность также в макак-резус, большинство из образцов кожи биопсии, как ожидается, шош положительную реакцию с антителами tTG2 но без присутствия tTG2 + IgA + двойной положительных клеток (рис. 4). Эти DH-несвязанных случаев, в том числе дерматит случаях микробного происхождения, откроет какой-либо одной-положительных IgA + клеток рассеяны под эпителием, но не спектрального перекрытия между tTG2 и IgA-меченых маркеров (рис. 3В и 4). Поэтому, очень важно для поддержания порядка предлагаемые процедуры тестирования, начиная с клинического обследования (рис. 1), а затем гистопатологические оценки (рис. 2) и только при отсутствии других, более общих дерматит возбудителей могут быть идентифицированы, конфокальной микроскопическое исследование кожи биопсии окрашивают в течение tTG2 и IgA является оправданным. Клинические и / или гистопатологические оценки сами по себе недостаточны для положительного диагноза этого заболевания. В тех случаях, когда двойной положительный (tTG2 + IgA +) клетки выявляются в районе кожных сосочков, DH-как дерматит диагноз может быть выдан. В таких случаях выход пищевого глютенаи администрирование безглютеновой диете рекомендуется для того, чтобы облегчить симптомы дерматита.

Рисунок 1. Паховой области EM96 макаки до (А) и после (б) снятие диетические клейковины в течение 5 недель. Реинтродукция диетические клейковины совпало с появлением дерматита (С).

Рисунок 2. HE окрашивание EM96 макаки биопсии кожи, собранные до (А) и после (б) снятие диетические клейковины в течение 9 недель. : Эпителий утолщен (7-15 слоев эпителиальных клеток) с толстым поверхностным коры гиперкератозом клетки проникли с нейтрофилов вырождается. Нейтрофилы появляются и внутри эпителия и смешиваются с умеренным количеством лимфоцитов, плазматических клеток и гистиоцитов вокруг придатков в верхней дерме. В: Некоторые hyperkeratОсис по-прежнему присутствует, эпителиальные толщина нормирован (4-7 слоев) с минимальным лимфоплазмоцитарной инфильтрации в верхней дерме. C: Нормальная кожа живота из FR56 макаки, ​​без лимфоплазмоцитарной инфильтрация, включена для сравнения. Увеличение 20x.

Рисунок 3. Конфокальной микроскопии изображений EM96 макаки биопсии кожи, собранные до (А) и после (б) снятие диетические клейковины в течение 9 недель. : IgA окрашивания (зеленый), tTG2 (красный) и ToPro-3 ядерных маркеров ДНК (синий). Сотрудничество локализации IgA и tTG2 появляется в желтой вокруг области кожных papilae. B: Кожа пробы после 9 недель безглютеновой диете не показывает IgA в эпителии то время как некоторые субэпителиальные IgA-прежнему присутствует (зеленый), tTG2 (красный) и ToPro-3 ядерных маркеров ДНК (синий).

Рисунок 4. конфокальной микроскопии изображений GI24 макак резус биопсии кожи, собранные во время животное демонстрировал симптомы хронической (DH-несвязанных) дерматит. Окрашивание IgA находится в зеленой, tTG2 в красном и ToPro-3 ядерных маркеров ДНК в синий цвет. TTG2 + клеток находятся внутри эпителия, несколько IgA + клеток под эпителием, а не интенсивно спектрального перекрытия между красными и зелеными маркерами видел.

Животное тегов	Секс [M / F]	Возраст [Лет]	Клинические симптомы	Плазменные tTG2 Антитела	Диета [1,2] *
HJ71	F	1,3	Здоровый	-	1
HD13	М	1,4	Здоровые, иногда диарея	+	1
FR56	М	5,4	Хроническая диарея идиопатический	-	1
EM96	F	5,0	Хронический дерматит	+ / - (Границы)	1 и 2
GI24	F	4,6	Хронический дерматит	-	1

Таблица 1. TNPRC макак-резус использоваться для сбора биопсии кожи

* Диета 1 - регулярные обезьяны чау (содержащих клейковину); Диета 2 - безглютеновой диете

Обсуждение

Наши вновь созданных без человеческих приматов модель клейковины чувствительности был недавно использован для изучения кишечных изменения проницаемости вызвано диетических клейковины ^5,6. Плазменные tTG2 антител, а также кишечных tTG2 + IgA + депозиты были обнаружены в некоторых глют...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагентов или оборудования	Компания	Номер по каталогу / Код товара	Примечание
Античеловеческие IgA-FITC *	Sigma, Сент-Луис, Миссури	F-5259	Рабочее разведение 1:100
Античеловеческие tTG2	Thermo Scientific, Каламазу, М. И.	MS-300-P1ABX	Рабочее разведение 1:100
Анти-мышь IgG1 **	Invitrogen, Карлсбад, Калифорния	-21124	Рабочее разведение 1:1000
ToPro-3 ДНК-зонда ***	Invitrogen, Карлсбад, Калифорния	T-3605	Рабочее разведение 1:1000
Цинк в формалине (Z-х)	Anatech ООО, Battle Creek, Мичиган	171
Замораживание октября Среда	Сакура Finetek, Торренс, Калифорния	4583
Монтаж Cytoseal Среда	Ричард Аллан-научного, Каламазу, М. И.	8312-4
Анти-Тушение Решение	Sigma, Сент-Луис, Миссури	P 3130
Ethilon (Нейлон Suture)	Ethicon, Johnson & Johnson, Беркшир, Великобритания	663G
Miltex Удар Кожные инструмент биопсии	Miltex, Йорк, Пенсильвания	Не Доступно
Остер Золотой A5 Одноместный Clipper Vet скорость с размером 40 лезвие	Остер Продукты, McMinnville, Т. Н.	78005-050
Leica тканей Процессор	Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, KS	ASP300
Ротари Микротом	Microm International, Вальдорф, Германия	HM325
Криостат	Thermo Scientific, Каламазу, М. И.	HM560
Конфокальной микроскопии	Leica, Wetzlar, Германия	TCS SP2