Reconhecimento da transglutaminase epidérmica por 2 Anticorpos IgA transglutaminase tecidular e em um caso raro de Rhesus Dermatite

Resumo

Dermatite herpetiforme (DH) é uma condição inflamatória crônica caracterizada por uma reação auto-imune entre IgA e transglutaminase epidérmica (ETG). DH se desenvolve em uma parcela muito pequena dos pacientes glúten-sensíveis e / ou doença celíaca. Os resultados deste estudo indicam que a DH também pode se desenvolver em um hospedeiro macaco rhesus com sintomas da dermatite idiopática.

Resumo

Transglutaminase tecidular 2 (tTG2) é uma enzima digestiva intestinal que deamidates já parcialmente digeridos da dieta do glúten peptídeos gliadina por exemplo. Em indivíduos geneticamente predispostos, tTG2 desencadeia respostas auto-imunes que se caracterizam pela produção de anticorpos e tTG2 sua deposição direta em ^1,2 parede do intestino delgado. A presença de tais anticorpos constitui uma das características principais da doença celíaca (CD). Transglutaminase epidérmica (ETG) é outro membro da família transglutaminase, que também pode funcionar como auto-antígeno em uma pequena minoria de pacientes com DC. Nestes casos relativamente raros, ETG desencadeia uma reação auto-imune (erupção cutânea) clinicamente conhecida como dermatite herpetiforme (DH). Embora o mecanismo exato da patogênese da DH CD e não é bem compreendida, sabe-se que tTG2 e ETG epítopos antigênicos partes que podem ser reconhecidas por anticorpos de soro de pacientes de CD e DH ^3,4.

(Macaca mulatta) com dermatite (Tabela 1, fig. 1 e 2) foi usado para estudar os tecidos afetados. Em um animal (EM96) uma sobreposição espectral de IgA e tTG2 anticorpos (Fig. 3) foi demonstrada. A presença de duplo-positivos tTG2 + + células IgA foi focada na epiderme profunda, em torno da papila dérmica. Isto é consistente com lesões descritas em pacientes DH ^3. Quando EM96 foi colocado em uma dieta livre de glúten, a dermatite, bem como tTG2 + IgA + depósitos desapareceu e já não eram detectáveis ​​(Figs. 1-3). Dermatite reapareceu no entanto, com base na re-introdução do glúten na dieta EM96 (não mostrado). Em macacos, incluindo animais com dermatite independentes, o tTG2 + + depósitos de IgA não foram detectadas. Dieta sem glúten-dependente remissão de dermatite em EM96 juntamente com presença de IgA + + tTG2 células em sua pele sugerem uma auto-imunes, como a DH-mecanismo para o desenvolvimento dessa condição. Este é o primeiro relatório de DH-como a dermatite em qualquer primata não-humano.

Protocolo

1. Coleta de amostra de biópsia de pele

1. Antes de procedimento de biópsia de pele, anestesiar animais por via intramuscular com 2,5 mg / kg de cloridrato de tiletamina e cloridrato de zolazepam mistura telazol (Fort Dodge Saúde Animal, Fort Dodge, IA). Monitorar os animais desde a administração do anestésico até decúbito e depois remover do seu gabinete.
2. Remover os pêlos da área de interesse da pele utilizando uma de Ouro Oster A5 Clipper Single Speed ​​Veterinária com uma lâmina de tamanho 40 (Oster Professional Products, McMinnville, TN) e preparar assepticamente com alternância matagal betadine e álcool. Garantir uma cortina fenestrado estéril sobre o local da biópsia selecionado.
3. Usando uma técnica asséptica, coloque um 4,0 milímetros Miltex Soco instrumento de biópsia cutânea (Miltex, York, PA) contra a pele enquanto gira o instrumento de 180 graus no sentido horário e anti-horário com leve pressão até que a biópsia transectos através das camadas dérmicas na ti subcutâneassue. Retirar a amostra da biópsia e agarrar a parte transeccionados da pele com uma pinça e livre do tecido subcutâneo.
4. Fechar o defeito da pele com fio de náilon 3-0 ligado a uma agulha 3 / 8 círculo de corte (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson Medical Limited, Berkshire, UK) em um padrão cruzado. Dar a todos os animais de cloridrato de buprenorfina 0,01 mg / kg (Hospira, Lake Forest, IL) por via intramuscular para analgesia pós-operatória.

2. Processamento das amostras

1. Trabalhar com amostras de biópsia da pele de dermatite crônica e controles saudáveis ​​macacos rhesus. Obter 2-3 (4 mm de diâmetro) biópsia amostras de cada animal.
2. Fix primeira amostra em formol de zinco (Z-fix, Anatech Ltd., Battle Creek, MI) por 24 horas, lave em água por 30 min, lave brevemente em etanol 70%, e coloque em ASP300 processador de tecido Leica (Leica Microsystems Inc. , Buffalo Grove, KS) onde o tecido é desidratado com graus ascendentes de 70%, 80%, 95% e 100% de etanol 48min cada (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), seguido por duas mudanças de xileno (Fisher).
3. Incorporar em media de parafina (Fisher) para armazenamento de longo prazo na temperatura ambiente. Coloque a-20oC por 20 min antes do corte. Prepare 6 seções M usando um micrótomo rotativo (HM325, Microm International, Waldorf, Alemanha). Seções lugar em slides cobrado (Fisher) e ar seco a 60 º C durante a noite. Mancha com hematoxilina e eosina (H & E) método padrão (descritas abaixo).
4. Fix segunda amostra em paraformaldeído 2% (USB Corp, Cleveland, OH) por 30 min em temperatura ambiente, lavar três vezes em tampão fosfato salino (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), lugar em sacarose 30% (Fisher) para 4 horas, e incorporar em outubro média de congelamento (Sakura Finetek, Torrence, CA). Mantenha a-80oC por 20 min antes do corte. Prepare 15 seções M utilizando o criostato (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).

3. Coloração H & E

1. Deparaffinize incorporarseções ded por três mudanças de xilenos (Fisher) e hidratar através etanóis classificados: três alterações de 100%, duas mudanças de 95%, uma mudança de 80% e água destilada, 2 min cada um.
2. Mancha com hematoxilina (Richard Allan-Científico, Kalamazoo, MI) por um min e siga por uma lavagem rápida em água corrente.
3. Contracoloração com eosina (Sigma) por 6 min.
4. Desidratar os tecidos manchados por 95% e etanol absoluto, duas mudas de 2 min cada um e em seguida, desmarque em três mudanças de xilenos, 3 min cada.
5. Monte lamela usando Meio de Montagem Cytoseal (Richard Allan-Científica) sobre a H & E-seções manchada do tecido.

4. Avaliação histopatológica

Inspecionar H & E-corados biópsia da pele sob um microscópio de luz usando a 4 - aumento 40x e microscópio Leica com um SPOT introspecção câmera digital (Digital Instruments Inc., Michigan, EUA).

5. Imunofluorescência staining

1. Trabalhar com seções outubro-embedded da pele para a coloração de imunofluorescência. Antes da coloração, de molho por 20 min em PBS contendo 0,2% de peixes de pele de gelatina (FSG, Sigma) com 0,1% Triton X-100 (Sigma) para remover a outubro e de permeabilizar o tecido.
2. Depois de lavar os slides, incube com 10% de soro normal de cabra (NGS, Sigma), diluído em PBS-FSG por 1 hora, à temperatura ambiente, em uma câmara de corrediça umidificado.
3. Para visualizar a deposição de IgA e tTG2 anticorpos, incubar slides com anti-rhesus IgA e tTG2 anticorpos primários, diluídos em 10% NGS-PBS-FSG por 1 hora.
4. Lavar com X-100 PBS-FSG-Triton (Sigma) por 10 min, seguido por PBS-FSG por 10 min.
5. Incube com secundário, isotipo de anticorpos específicos marcados com fluorocromos Alexa Fluor 488 (verde), 568 (vermelho) ou 633 (azul) (Molecular Probes-Invitrogen) na diluição 1:1.000. Use o corante ToPro-3 para visualizar o DNA nuclear. Use os 10% NGS-PBS-FSG como diluente de anticorpo.
6. Use a solução anti-quenching (Sigma) para montar as seções de tecido manchado.

6. Confocal imagem

Realizar imagens com uma Leica TCS SP2 microscópio de varredura confocal a laser Verdadeiro (Leica, Wetzlar, Alemanha) equipado com três lasers (seis linhas disponíveis para a excitação): um laser de argônio-krypton a 488 nm (verde), um laser de 568 nm krypton ( vermelho) e um laser de hélio-neon a 633 nm (azul), que se estendem do visível para o lado vermelho do espectro. Registro de contraste de interferência diferencial (DIC) de imagens para avaliação das organizações não-rotulados arquitetura do tecido.

7. Resultados representante

Um exemplo de reconhecimento positivo da ETG por ambos tTG2 e IgA é mostrado na figura. 3A. Consistentes com a situação em pacientes humanos e devido à prevalência muito menor de DH-como a dermatite de CD-like sensibilidade ao glúten também em macacos rhesus, a maioria das amostras de biópsia da pele são esperados para show a reação positiva com anticorpos tTG2 mas sem a presença de IgA + + tTG2 dupla células positivas (Fig. 4). Nestes casos DH-independentes, incluindo os casos de dermatite de origem microbiana, vai revelar alguns single-células positivas + IgA espalhados sob o epitélio, mas não sobreposição espectral entre as tTG2 e IgA-rotulados marcadores (Figs. 3B e 4). Portanto, é importante manter a ordem dos procedimentos de teste sugerido, começando com o exame clínico (Fig. 1), seguido de avaliação histopatológica (Fig. 2) e apenas se não houver dermatite causador da doença, outros agentes mais comuns podem ser identificados, confocal exame de microscopia de biópsias de pele manchada para tTG2 e IgA é garantido. Avaliações clínicas e / ou histopatológico por si só não são suficientes para o diagnóstico positivo desta condição. Nos casos em duplo positivo (tTG2 + IgA +) células são identificadas em torno da área de papilas dérmicas, DH-como o diagnóstico de dermatite pode ser emitido. Em tais casos, retirada do glúten da dietae administração de dieta livre de glúten é recomendado para aliviar os sintomas da dermatite.

Figura 1. Região inguinal de EM96 macaco antes (A) e após (B) a retirada do glúten da dieta durante 5 semanas. Reintrodução do glúten da dieta coincidiu com o reaparecimento de dermatite (C).

Figura 2. Coloração HE de EM96 biópsias de pele macaco coletados antes (A) e após (B) a retirada do glúten da dieta por nove semanas. A: Epitélio é engrossado (7-15 camadas de células epiteliais), com uma grossa crosta superficial de células hyperkeratotic infiltradas com neutrofilos degenerando. Neutrófilos aparecem também no interior do epitélio e são misturados com números moderada de linfócitos, células plasmáticas e histiócitos em torno do anexos na derme superior. B: Alguns hyperkeratosis ainda está presente, espessura epitelial é normalizada (4-7 camadas) com infiltração mínima linfoplasmocitário na derme superior. C: pele abdominal normal a partir do FR56 macaco, sem infiltração linfoplasmocitário, está incluído para comparação. Ampliação de 20x.

Figura 3. Imagens de microscopia confocal de EM96 biópsias de pele macaco coletados antes (A) e após (B) a retirada do glúten da dieta por nove semanas. A: coloração IgA (verde), tTG2 (vermelho) e ToPro-3 marcador de DNA nuclear (azul). Co-localização de IgA e tTG2 aparece em amarelo ao redor da área de papilas dérmicas. B: amostra de pele tomada após 9 semanas de dieta sem glúten não mostra IgA dentro do epitélio, enquanto alguns IgA subepitelial ainda está presente (verde), tTG2 (vermelho) e ToPro-3 marcador de DNA nuclear (azul).

Figura 4. As imagens de microscopia confocal de GI24 biópsias de pele rhesus coletados enquanto animal foi exibindo os sintomas da dermatite (DH-independentes) crônica. A coloração IgA é a verde, em vermelho e tTG2 ToPro-3 marcador de DNA nuclear é em azul. As células + tTG2 estão presentes dentro do epitélio, alguns IgA + células abaixo do epitélio, enquanto que há sobreposição espectral extensa entre os marcadores de vermelho e verde é visto.

Tag animais	Sexo [M / F]	Idade [Anos]	Os sintomas clínicos	Plasma tTG2 anticorpos	Dieta [1,2] *
HJ71	F	1,3	Saudável	-	1
HD13	M	1,4	Diarréia, saudável ocasional	+	1
FR56	M	5,4	Diarréia crônica idiopática	-	1
EM96	F	5,0	Dermatite crônica	+ / - (Limítrofe)	1 e 2
GI24	F	4,6	Dermatite crônica	-	1

Tabela 1. TNPRC macacos rhesus utilizado para a coleta de biópsias de pele

* A dieta 1 - regular macaco Chow (glúten contendo); Dieta 2 - dieta sem glúten

Discussão

Nosso recém-criado modelo de primatas não-humanos da sensibilidade ao glúten foi recentemente utilizado para estudar as mudanças da permeabilidade intestinal desencadeada pelo glúten na dieta ^5,6. Plasma tTG2 anticorpos, assim como intestinal tTG2 + + depósitos de IgA foram detectados em alguns macacos glúten-sensível. Desde que identificado recentemente incidentes raros de dermatite idiopática em colônia de macacos rhesus, onde nenhuma etiologia (infecciosas / metabólica) usual pôde ser estabelec...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente ou equipamento	Companhia	Número Catálogo / Código	Nota
IgA anti-humana-FITC *	Sigma, St. Louis, MO	F-5259	1:100 diluição de trabalho
Anti-Human tTG2	Thermo Scientific, Kalamazoo, MI	MS-300-P1ABX	1:100 diluição de trabalho
Anti-IgG1 **	Invitrogen, Carlsbad, CA	A-21124	1:1.000 diluição de trabalho
ToPro-3 DNA *** sonda	Invitrogen, Carlsbad, CA	T-3605	1:1.000 diluição de trabalho
Zinco formalina (Z-fix)	Anatech Ltd., Battle Creek, MI	171
Congelamento outubro Médio	Sakura Finetek, Torrence, CA	4583
Cytoseal Montagem Médio	Richard Allan-Científico, Kalamazoo, MI	8312-4
Anti-Quenching Solução	Sigma, St. Louis, MO	P 3130
Ethilon (Sutura Nylon)	Ethicon, Johnson & Johnson, Berkshire, Reino Unido	663G
Miltex Soco instrumento de biópsia cutânea	Miltex, York, PA	NA
Oster A5 Ouro Clipper Vet Único de velocidade com uma lâmina de tamanho 40	Oster Produtos, McMinnville, TN	78005-050
Leica Processor Tissue	Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, KS	ASP300
Micrótomo rotativo	Microm International, Waldorf, na Alemanha	HM325
Criostato	Thermo Scientific, Kalamazoo, MI	HM560
Microscópio confocal	Leica, Wetzlar, Alemanha	TCS SP2