Die Anerkennung der Epidermal Transglutaminase von IgA und Tissue Transglutaminase 2 Antikörper in einem seltenen Fall von Rhesus Dermatitis

Zusammenfassung

Dermatitis herpetiformis (DH) ist eine chronische entzündliche Erkrankung durch eine Autoimmunreaktion zwischen IgA und epidermalen Transglutaminase (ETG) gekennzeichnet. DH entwickelt sich in einem sehr kleinen Teil der gluten-sensitive und / oder Zöliakie-Patienten. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass DH kann auch in einem Rhesusaffen-Host mit Symptomen der idiopatic Dermatitis zu entwickeln.

Zusammenfassung

Tissue Transglutaminase 2 (tTG2) ist ein Verdauungsenzym im Darm, die bereits teilweise verdaute Nahrung Gluten zB Gliadinpeptide deamidates. In genetisch vorbelasteten Personen, löst tTG2 autoimmune Reaktionen, die durch die Produktion von tTG2 Antikörpern und deren direkte Ablagerung in kleine Darmwand ^1,2 gekennzeichnet sind. Das Vorhandensein solcher Antikörper ist eine der wichtigsten Kennzeichen der Zöliakie (CD). Epidermal Transglutaminase (ETG) ist ein weiteres Mitglied der Transglutaminase-Familie, die auch als Autoantigen in einer kleinen Minderheit von Patienten CD funktionieren kann. In dieser relativ seltenen Fällen löst ETG eine Autoimmunreaktion (Hautausschlag) klinisch als Dermatitis herpetiformis (DH) bekannt. Obwohl der genaue Mechanismus der CD und DH Pathogenese ist nicht gut verstanden, es ist bekannt, dass tTG2 und ETG Aktien antigene Epitope, die durch Serum-Antikörper von CD-und DH-Patienten ^3,4 erkannt werden können.

(Macaca mulatta) mit Dermatitis (Tabelle 1, Abb.. 1 und 2) wurde verwendet, um die betroffenen Gewebe zu studieren. In einem Tier (EM96) eine spektrale Überlappung von IgA und tTG2 Antikörper (Abb. 3) wurde demonstriert. Die Anwesenheit von Doppel-positive tTG2 + IgA + Zellen wurde in den tiefen Epidermis, um die dermalen Papillen konzentriert. Dies steht im Einklang mit Läsionen in DH-Patienten ³ beschrieben. Wenn EM96 auf eine glutenfreie Diät, die Dermatitis, sowie gelegt wurde tTG2 + IgA + Ablagerungen verschwunden und wurden nicht mehr nachweisbar (Abb. 1-3). Dermatitis jedoch auf Wiedereinführung der Nahrung Gluten in EM96 (nicht dargestellt) wieder auf. In anderen Makaken einschließlich Tier mit nicht verwandten Dermatitis wurden die tTG2 + IgA + Ablagerungen nicht erkannt. Gluten-freie Diät-abhängige Vergebung der Dermatitis in EM96 zusammen mit Anwesenheit von tTG2 + IgA + Zellen in der Haut deuten auf eine Autoimmunerkrankung, DH-likeMechanismus für die Entwicklung dieses Zustandes. Dies ist der erste Bericht von DH-ähnliche Dermatitis in jeder nicht-menschlichen Primaten.

Protokoll

1. Hautbiopsie Probenentnahme

1. Vor Hautbiopsie Verfahren, betäuben Tieren intramuskulär mit 2,5 mg / kg Tiletamin angewendet Hydrochlorid und Zolazepam Hydrochlorid telazol Mischung (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Überwachen Sie die Tiere aus der Anästhesie bis zum Liegen und entfernen Sie dann aus ihrem Gehege.
2. Entfernen Sie die Haare aus der Haut Gebiet von Interesse unter Verwendung eines Oster Golden A5 Single Speed ​​Veterinary Clipper mit einer Größe 40 Klinge (Oster Professional Products, McMinnville, TN) und aseptisch mit wechselnden betadine Peeling und Alkohol vorzubereiten. Sichern Sie sich eine sterile gefenstert Tuch über den ausgewählten Biopsiestelle.
3. Mit einer sterilen Technik, statt einer 4,0 mm Miltex Punsch Dermal Biopsie-Instrument (Miltex, York, PA) gegen die Haut beim Drehen des Geräts um 180 Grad im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn mit leichtem Druck bis zum Biopsiestanze Transekte durch die Hautschichten in das subkutane tissue. Entfernen Sie die Biopsie-Probe und fassen Sie die durchtrennten Teil der Haut mit einer Pinzette und frei aus dem subkutanen Gewebe.
4. Schließen Sie die Hautdefekt mit 3-0 Nylonfaden an einem 3 / 8 Kreis schneidende Nadel (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson Medical Limited, Berkshire, UK) in einer Kreuzband-Muster. Gib alle Tiere 0,01 mg / kg Buprenorphin-Hydrochlorid (Hospira, Lake Forest, IL) intramuskulär für postoperative Analgesie.

2. Aufbereitung der Probe

1. Die Arbeit mit der Haut Biopsie-Proben von chronischen Dermatitis und gesunden Kontrollpersonen Rhesusaffen. Erhalten zwei vor drei (4 mm im Durchmesser) Biopsie-Proben von jedem Tier.
2. Fix erste Probe in Zink Formalin (Z-fix, Anatech Ltd, Battle Creek, MI) für 24 Stunden in Wasser waschen für 30 min, waschen kurz in 70% Ethanol, und platzieren Sie in ASP300 Leica Gewebe-Prozessor (Leica Microsystems Inc. , Buffalo Grove, KS), bei der Gewebe entwässert mit aufsteigenden Klassen von 70%, 80%, 95% und 100% Ethanol 48min jeweils (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), gefolgt von zwei Änderungen Xylol (Fisher) gefolgt.
3. Embed in Paraffin Medien (Fisher) für die langfristige Lagerung bei Raumtemperatur. Legen Sie bei -20 ° C für 20 min vor dem Schneiden. Bereiten Sie 6 um Abschnitte mit einem Rotationsmikrotom (HM325, Microm International, Waldorf, Deutschland). Legen Sie Bereiche auf geladene Objektträger (Fisher) und an der Luft trocknen bei 60 ° C über Nacht. Stain mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) Standard-Methode (siehe unten).
4. Fix zweite Probe in 2% Paraformaldehyd (USB Corp, Cleveland, OH) für 30 min bei Raumtemperatur, waschen dreimal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), in 30% Saccharose (Fisher) für 4 Stunden, und betten in OCT Einfriermedium (Sakura Finetek, Torrence, CA). Keep at-80oC für 20 min vor dem Schneiden. Bereiten 15 um Abschnitte mit dem Kryostaten (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).

3. H & E Färbung

1. Entparaffinieren einbettended Schnitte durch drei Änderungen der Xylole (Fisher) und rehydrieren durch abgestufte ethanole: drei Änderungen von 100%, zwei Änderungen von 95%, eine Veränderung von 80% und destilliertes Wasser, 2 min je.
2. Stain mit Hämatoxylin (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) für eine Minute und folgen Sie durch einen kurzen waschen in fließendem Leitungswasser.
3. Gegenfärbung mit Eosin (Sigma) für 6 min.
4. Entwässern gefärbten Geweben bis 95% und absolutem Ethanol, zwei Änderungen von je 2 min und deaktivieren Sie dann in drei Änderungen der Xylole, jeweils 3 min.
5. Berg Deckglas mit Cytoseal Eindeckmedium (Richard-Allan Scientific) über die H & E-gefärbten Gewebeschnitten.

4. Histopathologische Beurteilung

Überprüfen Sie H & E-gefärbten Biopsie Haut Abschnitte unter einem Lichtmikroskop mit den 4 - 40-facher Vergrößerung und Leica-Mikroskop mit einem SPOT Insight Digitalkamera (Digital Instruments Inc., Michigan, USA).

5. Immunfluoreszenz staiPlanung

1. Arbeiten Sie mit OCT-embedded Haut Abschnitte für Immunfluoreszenzfärbung. Vor dem Färben, für 20 min in PBS mit 0,2% Fischhaut Gelatine (FSG, Sigma) mit 0,1% Triton X-100 (Sigma) für die ÜLG zu entfernen und das Gewebe permeabilisieren einweichen.
2. Nach dem Waschen der Objektträger mit 10% normalem Ziegenserum (NGS, Sigma), in PBS-FSG für 1 Stunde verdünnt, bei Raumtemperatur inkubieren, in einem befeuchteten Objektträger Kammer.
3. Um die Ablagerung von IgA und tTG2 Antikörper sichtbar zu machen, inkubieren Folien mit Anti-Rhesus-IgA und tTG2 Primärantikörper, in 10% NGS-PBS-FSG für 1 Stunde verdünnt.
4. Waschen mit PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) für 10 min, von PBS-FSG für 10 min.
5. Inkubieren mit sekundären, Isotyp-spezifischen Antikörper mit Alexa Fluor Fluorochrom 488 (grün), 568 (rot) oder 633 (blau) (Molecular Probes-Invitrogen) bei 1:1000 Verdünnung getaggt. Verwenden Sie die TOPRO-3 Farbstoff auf die Kern-DNA sichtbar zu machen. Verwenden Sie die 10% NGS-PBS-FSG als Antikörperverdünnung.
6. Verwenden Sie die Anti-Abschrecken Lösung (Sigma), um den gefärbten Gewebeschnitten zu montieren.

6. Konfokale Bildgebung

Führen Sie die Belichtung mit einer Leica TCS SP2 Wahre konfokale Laser Scanning Mikroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland) mit drei Lasern (sechs Zeilen für die Anregung zur Verfügung) ausgestattet: einem Argon-Krypton-Laser bei 488 nm (grün), einer Krypton-Laser bei 568 nm ( rot) und einem Helium-Neon-Laser bei 633 nm (blau), die von den sichtbaren bis in den Fernen-roten Seite des Spektrums erstrecken. Rekord Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Bilder für die Bewertung von nicht-markierten Gewebe-Architektur.

7. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel für positive Anerkennung der ETG von beiden tTG2 und IgA-Antikörper ist in Abb. dargestellt. 3A. In Übereinstimmung mit Situation in menschlichen Patienten und wegen der viel geringeren Prävalenz von DH-ähnliche Dermatitis als CD-like Glutenempfindlichkeit auch in Rhesusaffen, sind die meisten der Haut Biopsie-Proben, um sho erwartetw die positive Reaktion mit Antikörpern tTG2 aber ohne die Anwesenheit von tTG2 + IgA + Doppel-positiven Zellen (Abb. 4). Diese DH-unabhängigen Fällen, einschließlich Dermatitis Fällen mikrobiellen Ursprungs, wird zeigen, einige Einzel-positive IgA + Zellen unter dem Epithel verstreut, aber nicht spektrale Überlappung zwischen den tTG2 und IgA-markierten Marker (Abb. 3B und 4). Daher ist es wichtig, die Reihenfolge der vorgeschlagenen Prüfverfahren zu erhalten, beginnend mit der klinischen Untersuchung (Abb. 1), von histopathologischen Auswertung (Abb. 2) und nur dann, wenn keine andere, häufiger Dermatitis erregenden Stoffe identifiziert werden können, konfokale gefolgt mikroskopische Untersuchung von Hautbiopsien für tTG2 und IgA gebeizt gerechtfertigt ist. Klinische und / oder histopathologischen Auswertungen alleine sind nicht ausreichend für eine positive Diagnose dieser Erkrankung. In jenen Fällen, in denen doppelt positiven (tTG2 + IgA +)-Zellen in der Gegend von dermalen Papillen sind identifiziert, DH-ähnliche Dermatitis Diagnose ausgegeben werden können. In solchen Fällen, Entzug von Nahrung Glutenund Verwaltung von glutenfreien Diät wird empfohlen, um die Dermatitis Symptome zu lindern.

Abbildung 1. Inguinalgegend der EM96 Makaken vor (A) und nach (B) Entzug der Nahrung Gluten für 5 Wochen. Die Wiedereinführung der Nahrung Gluten fiel mit dem Wiedererscheinen der Dermatitis (C).

Abbildung 2. HE-Färbung der EM96 Makaken Hautbiopsien gesammelt vor (A) und nach (B) Entzug der Nahrung Gluten für 9 Wochen. A: Das Epithel ist verdickt (7-15 Lagen von Epithelzellen) mit einer dicken Kruste von oberflächlichen hyperkeratotic Zellen infiltriert mit degenerierenden Neutrophilen. Neutrophile erscheinen auch im Inneren des Epithels und sind mit moderaten Anzahl von Lymphozyten, Plasmazellen und Histiozyten um die Adnexe in der oberen Dermis gemischt. B: Einige hyperkeratosis noch vorhanden ist, ist Epitheldicke normalisiert (4-7 Schichten) mit minimalem lymphoplasmazelluläre Infiltration in der oberen Dermis. C: Normal Bauchhaut von FR56 Makaken, ohne lymphoplasmazelluläre Infiltration, wird für den Vergleich einbezogen. Vergrößerung 20x.

Abbildung 3. Konfokale Mikroskopie Bilder EM96 Makaken Hautbiopsien gesammelt vor (A) und nach (B) Entzug der Nahrung Gluten für 9 Wochen. A: IgA-Färbung (grün), tTG2 (rot) und Topro-3 Kern-DNA-Marker (blau). Co-Lokalisation von IgA und tTG2 erscheint in Gelb um den Bereich der dermalen papilae. B: Hautprobe nach 9 Wochen entnommen glutenfreie Ernährung zeigt keine IgA im Epithel, während einige subepitheliale IgA noch vorhanden ist (grün), tTG2 (rot) und Topro-3 Kern-DNA-Marker (blau).

Abbildung 4. Die konfokale Mikroskopie Bilder von GI24 Rhesusaffen Hautbiopsien gesammelt, während Tier war ausstellenden die Symptome der chronischen (DH-unabhängigen) Dermatitis. Die IgA-Färbung ist in grün, tTG2 in rot und Topro-3 Kern-DNA-Marker in blau. Die tTG2 +-Zellen vorhanden sind, in das Epithel, wenig IgA + Zellen unter dem Epithel, während keine umfassende spektrale Überlappung zwischen den roten und grünen Markierungen zu sehen ist.

Tierische Tag	Sex [M / F]	Alter [Jahre]	Klinische Symptome	Plasma tTG2 Antikörper	Diät [1,2] *
HJ71	F	1,3	Gesund	-	1
HD13	M	1,4	Gesunde, gelegentlich Durchfall	+	1
FR56	M	5,4	Chronische idiopathische Durchfall	-	1
EM96	F	5,0	Chronische Dermatitis	+ / - (Grenzwertig)	1 und 2
GI24	F	4,6	Chronische Dermatitis	-	1

Tabelle 1. TNPRC Rhesusaffen für die Sammlung von Hautbiopsien verwendet

* Diät 1 - regelmäßige Affen chow (Gluten-haltigen); Diet 2 - glutenfreie Ernährung

Diskussion

Unsere neu gegründete nicht-menschlichen Primaten Modell der Glutenunverträglichkeit eingesetzt wurde, um die intestinale Permeabilität Veränderungen durch diätetische glutenfreie ^5,6 ausgelöst zu studieren. Plasma tTG2 Antikörper sowie Darm tTG2 + IgA + Einlagen wurden in einigen gluten-sensitive Makaken entdeckt. Da wir selten Fälle von idiopathischer Dermatitis vor kurzem in Kolonie identifiziert Rhesusaffen, bei denen keine übliche (infektiöse / Stoffwechsel) Ätiologie festgestellt werden konnt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes oder Ausrüstung	Firma	Katalog-Nummer / Product Code	Note
Anti-Human IgA-FITC *	Sigma, St. Louis, MO	F-5259	1:100 Gebrauchsverdünnung
Anti-Human tTG2	Thermo Scientific, Kalamazoo, MI	MS-300-P1ABX	1:100 Gebrauchsverdünnung
Anti-Mouse IgG1 **	Invitrogen, Carlsbad, CA	A-21124	1:1000 Gebrauchsverdünnung
TOPRO-3-DNA-Sonde ***	Invitrogen, Carlsbad, CA	T-3605	1:1000 Gebrauchsverdünnung
Zink Formalin (Z-fix)	Anatech Ltd, Battle Creek, MI	171
Oktober Freezing Medium	Sakura Finetek, Torrence, CA	4583
Cytoseal Montage Medium	Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI	8312-4
Anti-Quenching Lösung	Sigma, St. Louis, MO	P 3130
Ethilon (Nylonfaden)	Ethicon, Johnson & Johnson, Berkshire, UK	663G
Miltex Punsch Dermal Biopsieinstruments	Miltex, York, PA	NA
Oster Golden A5 Single Speed ​​Vet Clipper mit einer Größe 40 Blatt	Oster Produkte, McMinnville, TN	78005-050
Leica Tissue Processor	Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, KS	ASP300
Rotationsmikrotom	Microm International, Waldorf, Deutschland	HM325
Kryostat	Thermo Scientific, Kalamazoo, MI	HM560
Konfokalmikroskop	Leica, Wetzlar, Deutschland	TCS SP2