哺乳动物细胞培养，使用一种新的多层瓶中的比例增加

摘要

细胞发挥在研究的工具和越来越大的作用，并发现和开发新疗法。有了这个我们需要更有效率和更有效的方式，为种植和收获附件依赖细胞的细胞数量增加的需要。一个正确的功能的多层瓶中可以达到这个目的。

摘要

一个基于单元的应用越来越多，需要大量的细胞。单层T型瓶，是在小规模的扩大足够的使用，有可能成为累赘，费力又费时，需要大量的细胞。要解决这个问题需要，一个新的多层细胞培养容器的性能，以促进细胞单层的T -烧瓶易规模将讨论。烧瓶测试可在3 - 5层的格式和使文化和完全恢复三种细胞数量的五倍，比T - 175烧瓶。屋宇署多瓶的一个主要特点是混合/平衡端口，允许在血管混合以及内部和之间的每艘船舶层细胞和试剂的均匀分布，并不断产生的环境中，可以培养细胞快速是一致的T - 175烧瓶。

这些多保温瓶的设计也允许对C直接添加到瓶中的试剂和细胞以及高效回收有价值的细胞和试剂onvenient吸管访问和降低污染浇筑风险。浇筑超过吹打首选的应用程序，设计允许微小残留药液保留，以减少浪费宝贵的细胞和试剂。

研究方案

1。协议利用细胞培养多保温瓶

1. 船只，并加入细胞悬液的制备
   1. 需要准备细胞的生长介质。
   2. 行了多瓶，它面临在工作面上（无菌层流罩）第的一面垂直。
      1. 这些烧瓶是在3和5层的格式，并使用类似的工作流模式作为一个T - 175烧瓶。
   3. 松开并取下帽子。添加到使用50或100毫升吸管瓶或浇需要预热中等量。
      1. 滴管，≤10毫升即可到达容器底部时多保温瓶放在第朝上垂直。移液器≥10毫升立即到船只可以达到过去多瓶上的标志，从而提供了方便的门户媒体船只添加更大容量。
   4. 为了避免介质的冒泡，让液体流FLOW沿内壁的多瓶的盖子（徽标端）。
   5. 通过前层用10 mL的吸管和第烧瓶从一个集中的细胞股票添加到生长介质细胞悬液。

      提示:

      -运输多保温瓶上的孵化器网站的购物车和执行其余的步骤 。
      -细胞接种密度不同的细胞类型，媒介和文化的持续时间需要而异 。 开始播种密度和标准的T - 175烧瓶中使用的介质卷和乘以3或5，取决于多瓶使用的格式。

2. 混合细胞
   1. 混合的位置是:保持多瓶直立面对你的标志，反过来逆时针45 °的角度面对你与混合端口。
   2. 保持在相同的角度，轻轻地从正面倾斜多瓶，直到液体（颈部远离你）在顶层水渠充分downwar通过混合端口的DS。枢轴上混合端口端。
   3. 同样，轻轻摇动多瓶，从后向前（朝你的颈部），直到介质完全通过混合端口的底层朝上方的水渠。重复步骤1.2.2和1.2.3更多的时间来确保正确的混合。
   4. 多瓶混合位置（步骤1.2.1），并继续执行步骤1.3
   5. 此外，细胞悬液，可从外部多瓶准备细胞悬液，可以添加的船只使用吸管或温柔浇筑。
      1. 混合端口允许船与媒体的细胞混合，无需外部，使大量的细胞悬液。
      2. 它还允许跨多瓶层层媒体均衡
3. 流体平衡的
   1. 地方多瓶，混合后/加入细胞悬液，在平坦的工作表面垂直，以平衡液体体积方程LLY在所有的层。
4. 每一层的分区液体进入
   1. 你面临的标志保持多瓶，并顺时针旋转45 °角进行分区到每一层液体。

      提示:

      -为了达到最佳效果，重要的是平坦的工作表面使用的步骤1.3-1.4

5. 交通运输
   1. 一旦媒体含有细胞悬液被分割，运输多瓶相同的45 °角（顺时针方向）在与媒体远离进入孵化器的混合端口1.4.1步骤。从孵化器中删除时，烧瓶，在显微镜上观看，也适合这个位置。
6. 孵化器的货架放置到多瓶
   1. 控股多瓶，在45 °角（顺时针方向，远离混合端口），轻轻旋转，横向到孵化器的表面（从混合端口使用的角落里支点）。莱多瓶，标志朝上。
      1. 猎鹰多瓶设计允许堆放的船只，并认为他们的地方在一个坚固的堆叠肋骨。
7. 分布的细胞和试剂
   1. 多瓶平放在工作表面上后，轻轻摇动来回侧侧分发到文化的照顾，不要对泄漏液体从每一层表面的细胞均匀。堆栈烧瓶。
      1. 这种药剂是由透明材料，可以很容易地在显微镜观看和细胞上的最后一层。
8. 媒体交流
   1. 吸而倾斜多瓶到左边（混合港口边）你面临的标志。
   2. 然后倾斜，多瓶的权利，继续吸出所有剩余媒体。
   3. 添加适量的媒体，并按照步骤1.3-1.7

2。从多，保温瓶收获细胞

1. 游离细胞，最多多的保温瓶，垂直线，使每一个混合的位置（步骤1.2.1） 。轻轻地颠倒的脖子上，面临你，让媒体流失的顶层多瓶瓶。
2. 插入一个5年或10毫升通过颈部的吸尖，直到您到达液面附近的混合端口。吸用尽介质。
3. 添加解离试剂/洗涤缓冲液，使混合在步骤1.2.1 中的地位，然后进行后续步骤1.3-1.7中生长介质/中和剂倒入一个接收管细胞悬液或反转烧瓶等细胞流失容器顶部层和收集细胞，用10毫升吸管。

   提示 :为了提高细胞或试剂的复苏，带来多瓶组合位置（步骤1.2.1），对运营商与颈部反转，让媒体人的完整的排水系统 L层到顶层。然后，倾斜多瓶顺时针45 °角（远离组合端口），而多瓶仍然倒。使用移液管（1-10毫升）收集任何其余试剂。

3。推荐工作容积在猎鹰多瓶

生长介质

3层:每多瓶75-150毫升
5层:每多瓶125-250毫升

解离剂

3层:≥15毫升，每多瓶
5层:≥25毫升，每多瓶

提示:开始使用标准的T - 175烧瓶中等量，乘以3年或5倍多瓶的格式取决于评估，使每单位面积毫升保持不变 。

4。代表性的成果:

1 猎鹰多瓶的设计。

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图1:多瓶细胞培养容器可在3 - 5层，提供525和⁸⁷⁵平方厘米表面生长区，分别的细胞规模可堆叠格式。移液器的访问有利于增加和清除细胞及试剂和出的船只。混合端口的存在允许快速船混合和跨多瓶的所有层媒体均等。

2， 细胞产量，使用多瓶:

这些船只在3层和5层的格式，对应于3和5倍的T - 175烧瓶表面积。因此，≥3倍和5倍（130 ± 6.8 × 10 ⁶和218 ± 23.6 × 10 ⁶细胞，分别）BHK - 21号（幼仓鼠肾细胞）种植，并从多瓶回收相比，T - 175瓶（43.2 ± 3.5 × 10 ⁶细胞;图2a）。每U的细胞产量NIT表面面积相当于3 - 5层多瓶和BHK - 21的T - 175瓶中，前列腺癌细胞LNCaP（人类前列腺腺癌细胞株），对H​​ep - G2（人肝癌细胞系），ECOPACK 2-293（人肾细胞）培养期为48 - 96H（图2b）在生长介质（35毫升）每一层细胞供应商（ATCC，Sigma和/或Clontech公司）的建议。列举一个自动化的VI -细胞计数^（1）细胞。

图2A:三到五倍的BHK - 21细胞生长和恢复3 - 5层多保温瓶相比，T - 175烧瓶。预期收益率是使用控制细胞平均产量确定的T - 175烧瓶三到五倍乘以3 - 5层多保温瓶（N = 4烧瓶/格式）。

图2B细胞每平方厘米²的产量相当于在3 - 5层多瓶和BHK - 21，肝癌，前列腺癌细胞LNCaP EcoPack2 - 293细胞的T - 175烧瓶。每个条形代表的平均4至6烧瓶。 BHK - 21细胞（11000 cells/cm2）培养72小时，LNCaP细胞（20000 cells/cm2）EcoPack2 - 293细胞（〜35,000 cells/cm2）培养96小时，HepG2细胞（25000细胞/厘米² ）培养48小时前收获。

3， 媒体之间分配层多瓶

细胞培养液（DMEM; Invitrogen公司）被添加到5层多瓶（250 mL/5-layer船只）和成层根据协议，上面描述的分区。通过钻探孔，在每一层和泵从个人层次的媒体，媒体分发。从每一层的液体的重量是相对统一的层与层之间，如在图3所示。它们如下:510.8 ± 0.73，50.3 ± 0.58，50.21 ± 0.13 49.88 ± 0.35 49.45 ± 0.37（GM）。

图3。均匀介质分布在5层多瓶五层。培养液中添加了多瓶（250 ml/5-layer船），平衡及分割为单个图层。通过媒体被抽成单个层钻孔和液体的重量，从每一层（N = 6瓶）的记录。

多瓶层间细胞分布 4。

可以增加细胞内的多瓶混合。我们模拟的细胞之间的分配使用多瓶大小相似，对细胞的珠层（10微米; PolySciences公司）。珠悬液加入到多瓶使用10毫升吸管通过顶层的船只和船只为递减媒体混合ribed在上面的协议。珠分布在每一层液和含珠被抽暂停从个人层次的钻孔。珠浓度从每一层上库尔特计数器读和记录。下面显示的是等价的层间珠分布在3层多瓶（图4a）。混合端口，使细胞和试剂多瓶层之间的均匀分布。

图4a:珠分布在3层多瓶三层。暂停的珠子（3.6 × 10 ⁶ /毫升）加入到多保温瓶免除中等（珠悬挂:介质体积为1:10，第二卷:第一卷）和混合型，平衡和分区步骤，使用的协议描述。阅读上的库尔特计数珠浓度从每一层（中等通过对每一层钻孔抽水）ER和记录。下面显示的是等效的层间珠分布在3 - 层多瓶（N = 5烧瓶）

所示ECOPACK 2-293增长3层补充生长介质中的多，保温瓶> 80％汇合的细胞染色模式的代表图像。细胞单层固定和结晶紫染色和多瓶层，然后切和图像扫描^（2）。注意，细胞图案多瓶（图4b）的所有层上的同质性。类似的结果，获得与评估（数据未显示）的多种细胞类型。

图4b:这个数字说明的多保温瓶层之间的同质化的细胞生长。 ECOPACK - 2 - 293细胞生长在3层多瓶和T - 175> 80％汇合固定，结晶紫染色。多瓶血管被切断，每个染色层扫描。

5，多瓶的空气供应。

花EcoPack2 - 293细胞培养96小时使用BioProfile佛雷斯分析仪^（3,4）（诺瓦生物医学）媒体分析，没有发现在5层多保温瓶与T - 175瓶（81.03细胞生长的空气饱和差± 1.9比83.4 ± 5.8％O _2的环境_）。

图5:空气饱和度（％O _2的环境）花了媒体类似的预混合媒体从5层多瓶与T - 175烧瓶。 EcoPack2 - 293细胞接种在35,000个细胞/厘米²的密度和培养96小时之前，媒体分析（N = 3瓶） 。

讨论

目前的研究表明，生产率的提高，多瓶的设计研究人员提供。虽然重要的是要按照上述最佳性能概述使用时多，保温瓶的步骤，有几个关键在这个协议中，被视为最重要的步骤。这些措施包括:（一）使用组合港口内的船只运送后分割成每个层层铺设多瓶平后，分区（三）流体顺时针45 °角度多瓶（二）细胞和试剂混合孵化器。

多瓶的正确使用，导致生产同质化的细胞群内每艘船^的 T ^{- 175}瓶（5）是一致的环境中培养。这些船只提供类似的足迹细胞的T - 175烧瓶3倍和5倍以上。 3和5层的船只提供，分别为525和875厘米增长领域，并提供空间和劳动力小号用户avings。组织培养表面处理媲美从而而不需要规模的标准烧瓶重新优化现有的文化条件或牺牲质量，同质性或^{细胞（6,7）}的性能。这也提供了与以前收集的数据的可比性。这些船只也可以涂上试剂，如胶原蛋白，纤维连接蛋白，D -聚赖氨酸的附着，生长和某些类型的细胞，如肝细胞^{8，kertainocytes 9，}在无血清培养基中生长的干细胞分化为专门的底层配方。涂层解决方案，可清除微小残留药液保留，以减少浪费宝贵的试剂以及有效去除涂层解决方案之前培养细胞。建议最佳介质卷培养细胞在多瓶范围从0.142-0.287毫升/厘米^2，这意味着每一层25-50毫升。不像另一个多层瓶，T他的产品提供快速船混合均匀分布的细胞内，每艘船的层间试剂以及在船只允许混合端口。不同的细胞系，小学文化和干细胞已被有效地扩大使用多的保温瓶。这些船只特别有利的高通量筛选，生产疫苗，病毒载体转染和细胞治疗的细胞，如大量的应用需求。

节省时间，空间，劳动力和减少废物的产生，是传统文化与单层船只多瓶的关键的奖金。我们可以约5中提取的干细胞数量的三倍，文化的T - 175烧瓶在同一空间使用3个，5层多保温瓶。这在节省空间的优点是不局限于为T - 175只，但也可以扩展到其他船只:一个标准滚瓶设备，适合常见的实验室孵化器房子〜4 ROLLER瓶（2200毫升），其中每个提供^850厘米 2表面积。 〜20日，5层多保温瓶可以在同一地区，被安置，从而提供了5倍的增长表面细胞培养。此外，在"走出去绿色"意识的提高，减少废物的产生的选项是非常可取的的。在这方面，有一个38％（5，T - 175瓶中的重量，而之一，5层多瓶的重量〜400克〜640克）减少废弃物产生，使用多功能保温瓶相比，T - 175瓶和这些优势导致减少废物贮存，处置成本和节省用户的经济。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂/设备名称	公司	目录＃	评论
3层组织培养处理525厘米2	BD公司	353143	BD公司细胞培养- BD猎鹰多，烧瓶
5层的组织培养处理875厘米2	BD公司	353144
100毫升移液器	BD公司	357600
10毫升吸管	BD公司	357551
5毫升吸吸管	BD公司	357501
50毫升的聚丙烯锥形管	BD公司	352070
T - 175瓶组织培养处理	BD公司	353028
革兰氏结晶紫	屋宇署	212525
DMEM培养液	Invitrogen公司	11885
GMEM	西格玛	G5154
RPMI - 1640	ATCC	30-2001
纪念	ATCC	30-2003
胰蛋白酶EDTA	龙沙	CC - 5012
胎牛血清	Invitrogen公司	16000-044
Tryptose磷酸盐肉汤	西格玛	T8159
BHK - 21细胞	西格玛	85011433
对Hep - G2，前​​列腺癌细胞LNCaP	ATCC
ECOPACK 2-293	Clontech公司
多聚甲醛	电子显微镜科学	15710
聚苯乙烯珠	PolySciences公司	24628-20
生物个人资料的Flex分析仪	诺瓦生物医学