Yeni çok katmanlı bir balon kullanarak Memeli Hücre Kültürü Ölçeği-Up

Özet

Hücreler enstrümantal bir araştırma ve artan bir rol oynar ve yeni terapötikler keşfi ve geliştirilmesi. Eklenti bağımlı hücreler büyüyen ve hasat için daha verimli ve etkin şekilde hücreler daha fazla sayıda bu artan ihtiyacı. Doğru özellikleri ile çok katmanlı bir şişenin bu amaca hizmet edebilir.

Özet

Giderek artan sayıda hücre tabanlı uygulamalar çok sayıda hücre gerektirir. Hücrelerin çok sayıda gerektiğinde, küçük ölçekli genişleme sırasında yeterli tek katmanlı T-matara, kullanımı, hantal, zahmetli ve zaman alıcı olabilir. Bu ihtiyacı karşılamak için, yeni bir çok katmanlı hücre kültürü geminin performansını kolay ölçekli T-şişeler tek katmanlı hücre kolaylaştırmak için ele alınacaktır. T-175 matara göre 5 kat formatı ve sırasıyla kültür ve tam üç kurtarma ve hücre sayısı beş kat etkinleştirmek - 3 test şişeler mevcuttur. BD Multi-Flask önemli bir özelliği de, damar karıştırma her geminin katmanları içinde ve arasında hücreler ve reaktiflerin yanı sıra tekdüze dağılım ve sürekli olduğu bir ortamda kültüre olabilir hücreleri üretmek hızlı sağlar mix / dengeleme bağlantı noktası T-175 şişeler için uyum.

C için bu Multi-şişeler tasarımı da sağlaronvenient pipet şişeler doğrudan reaktifler ve hücreler ekleyerek değerli hücreleri ve reaktiflerin yanı sıra etkin kurtarma için erişim ve dökme için bağlı kontaminasyon riskini azaltır. Dökme pipetleme tercih edilir uygulamalar için, tasarım, değerli hücreleri ve reaktiflerin israfını azaltmak amacıyla minimal rezidüel sıvı retansiyonu sağlar.

Protokol

1. Protokol, hücre kültürü için Multi-şişeler kullanmak için

1. Gemilerin hazırlanması ve hücre süspansiyonu ekleyerek
   1. Gerektiği gibi hücre büyüme ortamı hazırlayın.
   2. Multi-Flask dikey çalışma yüzeyi (steril laminer akış kaput) yukarı bakacak şekilde kapağı ile yan hizaya getirin.
      1. Bu şişeler 3 ve 5-katlı formatları ve T-175 şişesi de benzer bir iş akış deseni kullanabilirsiniz.
   3. Gevşetin ve kapaklarını çıkarın. 50 veya 100 mL pipet kullanarak balona ya da dökerek önceden ısıtılmış orta gerekli miktarda ekleyin.
      1. Multi-şişeler kapağı yukarı bakacak şekilde dik olarak yerleştirilir ≤ 10 ml geminin alt ulaşabilirsiniz Pipetler . Pipetler ≥ 10ml Çok Flask logo geçmiş, böylece damar medyanın büyük birimler eklemek için uygun bir portal sağlayan damar içine hemen ulaşabilirsiniz.
   4. Orta köpüren önlemek için, sıvı akışı fl izinÇok Flask kapak (logo tarafında) iç duvar boyunca ow.
   5. 10 ml pipet ve kap şişeler kullanarak üst katmanı sayesinde büyüme ortama konsantre bir hücre stokunun hücre süspansiyonu ekleyin.

      İpuçları:

      - Ulaştırma inkübatör sitesine sepeti Multi-şişeler ve geri kalan adımları uygulayın.
      - Hücre ekim yoğunluğu, hücre tipi, orta ve kültür süresine ihtiyaç bağlı olarak değişecektir . Standart T-175 şişelerde kullanılan tohum yoğunluğu ve medya hacmi ile başlayın ve biçimi kullanılır Multi-Flask bağlı olarak 3 veya 5 ile çarpın.

2. Hücre karıştırma
   1. Pozisyonu logosu bakacak şekilde dik tutun ve Multi-Flask sayacı 45 saat yönünde çevirin ° açı size dönük olacak şekilde karışımı bağlantı noktası ile karıştırın.
   2. Aynı açıyla tutarak yavaşça üst tabaka sıvı kadar önden arkaya doğru (sizden uzağa boyun) Multi-Flask eğim tamamen downwar dreneds karışımı bağlantı noktası üzerinden. Karışımı port tarafı üzerinde özetleyin.
   3. Aynı şekilde, orta karışımı bağlantı noktası üzerinden alt tabakadan üste doğru tamamen drene kadar nazikçe geri ön (size karşı boyun) Multi-Flask kaya. Adımlar 1.2.2 ve düzgün bir karışım sağlamak için 1.2.3 bir kez daha tekrarlayın.
   4. Karışım pozisyonlar (Adım 1.2.1) Multi-Flask getirin ve 1.3 adıma geçin
   5. Alternatif olarak, hücre süspansiyonu Multi-Flask dışarıdan hazırlanan ve hücre süspansiyonu bir pipet kullanarak gemi veya yumuşak dökerek eklenebilir.
      1. Mix bağlantı noktası medya ile hücrelerin damar mix yapma imkanı verir ve dışarıdan büyük miktarda hücre süspansiyonları yapma ihtiyacını ortadan kaldırır .
      2. Ayrıca, Multi-Flask katmanları arasında medya eşitleme sağlar
3. Sıvı, Denge
   1. Karıştırma / hücre süspansiyonu ekledikten sonra, yer Multi-Flask dikey düz bir çalışma yüzeyi üzerindeki sıvı hacim denklemleri eşitlemek içinlly tüm katmanları.
4. Her bir tabaka haline Bölme sıvı
   1. Multi-Flask logosu ile size dönük olacak şekilde tutun ve katmanların her birine bir sıvı bölümü ile 45 ° açı saat yönünde çevirin.

      İpucu:

      - En iyi sonuç için düz bir çalışma yüzeyi, Adımlar 1,3-1,4 için kullanmak önemlidir.

5. Taşıma
   1. Bir zamanlar medya hücre süspansiyonu içeren nakil Multi-Flask aynı 45 ° açı (saat yönünde) inkübatör içine karışımı bağlantı uzak medya ile Adım 1.4.1 olarak bölümlendirilmiş olduğundan emin olun. Bu pozisyon, bir mikroskop görüntülemek için inkübatör şişeler çıkarırken de uygundur.
6. Inkübatör raf üzerine Multi-balon yerleştirilmesi
   1. Multi-Flask Holding 45 ° açı (saat yönünde, uzak mix-port), yavaşça bir karışımı portu uzak köşesinde kullanarak (inkübatör yüzeye yatay aşağı döndürmekPivot). Logo yukarı bakacak şekilde Multi-Flask yatırın.
      1. Falcon Multi-Flask tasarım damarları yığılmış olmasını sağlar ve onları sağlam bir istifleme kaburga yerde tutar.
7. Hücre ve reaktifler Dağılımı
   1. Çalışma yüzeyinin düz Multi-Flask yerleştirdikten sonra hafifçe ileri geri ve yan yana rock ve her katman sıvı dökmemeye özen kültür yüzeylerinden eşit hücrelerini dağıtmak için. Matara yığını.
      1. Bu Flask optik olarak şeffaftır malzemeden üretilmiş olup, son kat hücreleri mikroskop altında kolayca görülebilir.
8. Medya döviz
   1. Aspire ederken logosu ile size dönük olacak şekilde sola doğru eğerek Multi-Flask (mix port tarafı).
   2. Sonra eğme, sağa Multi-Flask, artık tüm medya aspire devam etmektedir.
   3. Ekleyin ve uygun miktarda medya Adımlar 1,3-1,7 izleyin

2.Multi-şişeler Hasat hücrelerle

1. Hücreleri, çizgi Multi-şişeler dikey ilgimiz getirmek için her biri pozisyonlar (Adım 1.2.1) karıştırın. Şişeler medya Multi-Flask üst tabakası drenaj izin verecek şekilde boyun size bakacak şekilde yavaşça çevirin.
2. Karışımı limanı yakınlarında sıvı seviyesine ulaşana kadar boyun aracılığıyla 5 veya 10 ml aspire ucu yerleştirin. Bitkin orta aspire.
3. Disosiasyon reaktif / yıkama tamponu ekleyin ve Adım 1.2.1 'deki gibi pozisyon karıştırın getirmek, sonra devam edin ve aşağıdaki adımları 1,3-1,7 uygulayın. Büyüme orta / nötralize edici ajan ile nötralize hücre süspansiyonu ve bir tüp içine dökün VEYA hücreleri için drenaj şişesi gibi ters Geminin en üst tabakası ve 10 ml pipet kullanarak hücreleri toplamak.

   İpucu: al medya tam drenaj izin vermek için hücreleri veya reaktiflerin kurtarma geliştirmek pozisyonlar (Adım 1.2.1) karıştırmak için Multi-Flask getirmek, boyun operatöre doğru ters l katmanları üst tabakası. Multi-Flask ters kalırken, eğim Multi-Flask 45 ° açı (karışımı portu uzak) için saat yönünde. Kalan tüm reaktifler toplamak için bir pipet (1-10 ml) kullanın.

3. Falcon Multi-şişeler Önerilen çalışma hacmi

Büyüme medya

3-Layer: Multi-Flask başına 75-150 ml
5-Layer: Multi-Flask başına 125-250 ml

Disosiyasyon ajanı

3-Layer: Multi-Flask başına ≥ 15 ml
5-Layer: Multi-Flask başına ≥ 25 ml

İpucu: standart T-175 matara kullanılan orta hacimli ile başlayın ve 3 veya 5 kez birim yüzey alanı başına bu mL aynı kalacak şekilde değerlendirilir Multi-Flask formatına bağlı ile çarpın.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Falcon Multi-Flask 1. Tasarım

files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/>
Şekil 1: Multi-Flask Hücre Kültürü gemileri, 3 - 5-katmanlı ve ölçek sırasıyla 525 ve 875 ^cm 2 büyüme yüzey alanı sağlayan hücreleri istiflenebilir formatı . Pipet erişim ek ve içine ve dışına geminin hücreleri ve reaktiflerin çıkarılmasını kolaylaştırır. Mix-port varlığı, Multi-Flask tüm katmanlar arasında medya-damar hızlı karıştırma ve dengeleme sağlar.

2. Hücre Verimi Multi-Flask:

Bu gemiler, 3-katmanlı ve 5 katlı formatları 3'e uygun ve T-175 şişe 5 kat yüzey alanı mevcuttur. Buna göre, ≥ 3 ve 5 kez (130 ± 6.8 x 10 ⁶ ve 218 ± 23.6 x 10 ⁶ hücre), BHK-21 numarası (bebek Hamster böbrek) hücreler, T-175 kıyasla büyümüş ve Multi-Flask kurtarıldı matara (43.2 ± 3.5 x 10 ⁶ hücre; Fig.2A). U ortalama Hücre verimnit yüzey alanı 3 eşit miktarda idi - ve 5-katmanlı Multi-şişeler ve BHK-21 T-175 matara, LnCAP (insan prostat adenokarsinom hücre hattı), Hep-G2 (insan hepatokarsinoma hücre hattı), Ecopack 2-293 (insan böbrek hücre hattı) 48-96h hücre satıcısı (ATCC, Sigma ve / veya Clontech) tarafından önerilen büyüme ortamı (katman başına 35 ml) bir süre (Fig.2B) kültüre. Hücreler bir otomatik Vi-HÜCRE sayacı ⁽¹⁾ numaralandırılır.

Şekil 2A: BHK-21 hücre sayısı üç ve beş kez büyüdü ve kurtarılan 3 - ve 5-katmanlı Multi-şişeler T-175 matara. Beklenen verim ortalama hücre verim kontrolü kullanılarak tespit edilmiştir T-175, üç ve beş kez 3 ile çarpılır şişeler ve 5 katmanlı Multi-şişeler sırasıyla (n = 4 matara / format).

Şekil 2B: ^cm2 başına Hücre verim, eşdeğer 3 - ve 5-katmanlı Multi-şişeler ve BHK-21, LnCAP, HepG2 ve EcoPack2-293 hücre için T-175 şişeler . Her çubuk, 4 ila 6 şişe anlamına temsil eder. BHK-21 hücreleri (11.000 cells/cm2), 72 saat, LnCAP hücreleri (20.000 cells/cm2) ve EcoPack2-293 hücrelerinde (~ 35.000 cells/cm2) için kültüre edildi 96 saat ve HepG2 hücreleri (25.000 hücre / ^cm 2 kültüre edildi ) 48 saat için hasattan önce kültüre edildi.

3. Multi-Flask katmanları arasında Medya dağıtım

Hücre kültürü, orta (DMEM; Invitrogen) 5 katmanlı Çok şişeler (250 mL/5-layer gemi) eklenir ve protokol yukarıda açıklanan göre katmanlara bölünmüştür. Medya dağıtım bireysel katmanları dışarı pompalanır her katmanı ve medya üzerinde herhangi bir delik ile ölçüldü. Şekil 3'te gösterildiği gibi katman katman nispeten homojen olması için her katman kurtarıldı sıvı ağırlığı bulundu. Bunlar aşağıdaki gibidir: 510,8 ± 0.73, 50.3 ± 0.58, 50.21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gr).

Şekil 3, her beş kat 5 kat Multi-Flask Tekdüzen medya dağıtım . Hücre kültürü ortamı dengelenmiş ve bireysel katmanların bölümlenmiş Multi-şişeler (250 ml/5-layer gemi) eklendi. Medya bireysel katmanların ve sıvı ağırlığı içine delinmiş deliklerden dışarı pompalanır her katmanı (n = 6 şişeler) kaydedildi.

4. Multi-Flask katmanları arasında Hücre dağıtım

Hücreler Multi-Flask içinde eklenir ve karıştırılır. Biz boncuk (10μm, PolySciences Inc.) Kullanarak Multi-Flask katmanları arasında hücre simüle dağıtım boyutu hücrelere benzer. Boncuk süspansiyon üst tabaka ile 10 ml pipet kullanarak Multi-Flask damar içine eklenir ve azalan gibi damar medya ile karıştırılırYukarıdaki protokol ribed. Boncuk boncuk süspansiyonu bireysel katmanların dışarı pompalanır oldu içeren her katmanı ve sıvı delik dağıtımı ile ölçüldü. Her katman kurtarıldı Boncuk konsantrasyonu bir Coulter Sayaç okuma ve kaydedildi. 3-katmanlı Çoklu şişeler (Fig.4A) eşdeğer arası katmanlı boncuk dağılımları aşağıda gösterilmiştir. Mix-port, Multi-Flask katmanları arasında hücreler ve reaktiflerin homojen dağılımını sağlar.

Şekil 4A: 3-katmanlı bir Multi-Flask üç katmandan her Boncuk dağıtım . (Vol, Medya ses seviyesini 01:10: boncuk süspansiyonu hacim) boncuk süspansiyon (3,6 x10 ⁶ / ml), Multi-şişeler içine dağıtılır orta eklendi ve karışık, dengeleme ve açıklanan protokolünü kullanarak bölümü adımları takip . Her bir katman (orta her katman üzerinde delikler aracılığıyla pompalanan) kurtarıldı Boncuk konsantrasyonu Coulter Sayım okunduer ve kaydedildi. Katmanı Multi-şişeler (n = 5 şişeler) - 3 arası katmanlı eşdeğer boncuk dağılımları aşağıda gösterilmiştir

Aşağıda gösterildiği desteklenmiş büyüme medya 3-katmanlı Multi-şişeler>% 80 izdiham yetiştirilen hücreler Ecopack 2-293 boyanma temsilcisi görüntüleri. Hücre mono tabakaları sabit ve kristal viole ile boyandı ve Multi-Flask katmanlar daha sonra kesildi ve ^{görüntü (2)} taranır . Not hücre desenlendirme Multi-Flask (Fig.4B) tüm katmanları üzerinde homojen oldu. Birden fazla hücre tipleri değerlendirilir (veriler gösterilmemiştir) ile benzer sonuçlar elde edildi.

Şekil 4B: Bu rakam, Multi-Flasks katmanları arasında homojen hücre büyüme göstermektedir . 3-katmanlı Multi-şişeler ve T-175>% 80 izdiham büyüdü Ecopack-2-293 hücre sabit ve kristal viole ile boyandı. Multi-Flask damarları kesilmiştir ve her vitray tabaka tarandı.

5. Çoklu-Flask Hava kaynağı.

BioProfile FLEX analizörü ^(3,4) (Nova Biyomedikal) 96 saat için EcoPack2-293 hücre kültürü kullanarak harcanan medya analizi, Multi-5-katmanlı şişeler vs T-175 matara (81,03 yetiştirilen hücreler hava doygunluk fark olmadığını ± 1.9 vs 83.4 ± 5.8% ortam O _2).

Şekil 5: Hava harcanan medya saturasyonu (% ortam O ₂₎ 5-katlı Multi-şişeler vs T-175 matara önceden karıştırılmış medya benzer. EcoPack2-293 hücre yoğunluğu 35.000 hücre / cm ² numaralı seribaşı ve medya analizi (n = 3 şişeler) önce 96 saat kültüre edildi.

Tartışmalar

Bu çalışmada, Multi-Flask tasarım araştırmacılara sunduğu verimlilik artış göstermektedir. Multi-şişeler kullanarak optimum performans için yukarıda belirtilen adımları takip etmek önemli olmakla birlikte, bu protokolü en önemli gördüğü bazı kritik adımlar vardır. Bu bölünme Multi-Flask düz yazılan döşeme katmanları (iii) her birine sıvı bölümleme sonra saat yönünde 45 ° 'lik açıyla Multi-Flask taşıyan gemi, (ii) içinde karıştırın bağlantı noktasını kullanarak hücrelerin ve reaktifler karıştırma (i) inkübatör.

Multi-Flask doğru kullanımı ⁽⁵⁾ T-175 şişeler için birbiriyle uyumlu bir ortamda kültüre her geminin içinde homojen bir hücre popülasyonu üretimine yol açar. Bu gemiler, T-175 şişesi de benzer bir ayak izi 3 ve 5 kat daha fazla hücre sağlar. 3 ve 5 katlı gemi, sırasıyla 525 ve ^{875cm 2,} büyüme alanı sağlar ve alanı ve işçilik 'ın ikisinin de teklifkullanıcılara avings. Doku Kültürü Yüzey İşleme, böylece gerek kalmadan ölçek sağlayan standart şişeler ile karşılaştırılabilir yeniden optimize mevcut kültür koşulları, kalite, homojenlik ^{veya hücreleri (6,} 7) performans ödün. Bu aynı zamanda daha önce toplanan verileri ile karşılaştırılabilir sağlar. Bu gemiler aynı zamanda kollajen gibi reaktifler ile kaplı olabilir, ^hepatositler 8, ^{kertainocytes} 9, serum serbest medya yetiştirilen kök hücreler gibi bazı hücre tiplerinin eki, büyüme ve farklılaşma için özel bir alt tabaka sağlamak için poli-D-lizin, fibronektin formülasyonlar. Kaplama çözümler hücreleri kültür öncesinde kaplama çözümü etkili bir şekilde kaldırılması gibi değerli reaktiflerin israfını azaltmak amacıyla minimal rezidüel sıvı retansiyonu ile kaldırılabilir. Multi-şişeler aralığı 25-50 ml katman başına çevirmek 0,142-0,287 ml / cm ² kültür hücreleri önerilen en iyi medya hacmi. Çok katmanlı bir başka balon, t aksinekendi ürün sağlayan damar-damar karıştırma her bir geminin içinde ve katmanlar arasındaki hücreler ve reaktiflerin tekdüze dağılım olarak aynı zamanda hızlı bir karışımı-port sunuyor. Çeşitli hücre hatları, primer kültürlerinde ve kök hücre Multi-şişeler ile verimli bir şekilde büyütülüyor edilmiştir. Bu gemiler, yüksek kapasiteli tarama, aşı üretimi, viral vektör transfections ve hücre tedavisi gibi hücre çok sayıda talep uygulamalarında özellikle avantajlıdır.

Zaman, mekan, emek ve daha az atık üretimi Tasarruf tek katmanlı gemiler geleneksel kültürlere karşı Multi-Flask önemli kazançlar. Biz kültürü 5 hasat hücrelerin sayısı yaklaşık üç kat, T-175, 3 kullanarak aynı alanda bulunan şişeler, 5-katlı Multi-şişeler. Bu avantaj, yer tasarrufu T-175, sadece bunlarla sınırlı değildir, ancak aynı zamanda diğer gemilere uzatılabilir: ortak laboratuar inkübatörler evler sığar bir standart silindir şişe aparatı ~ 4 rol850cm ² yüzey alanı sağlar ler şişeleri her biri (2200 ml). Aynı bölgede, ~~ 20, 5-katlı Multi-şişeler böylece kültür hücreleri beş kat büyüme yüzey sağlayarak yerleştirilebilir. Ayrıca, "Go Green" farkındalık bir artış ile, atık oluşumunu azaltmak için seçenekleri son derece arzu edilir. Bu bağlamda,% 38, T-175 matara ve bu avantajlar ile karşılaştırıldığında Multi-şişeler kullanarak atık üretiminin azalması kurşun (5, T-175 matara, biri 5 katlı Multi-Flask ~ 400g ağırlığında iken ~ 640g ağırlığında) var atık depolama ve bertaraf maliyetleri ve kullanıcıya ekonomik tasarruf sonucu meydana gelen azalma.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Ekipman Adı	Şirket	Katalog #	Yorumlar
3-katmanlı Doku Kültürü ile tedavi edilen 525cm 2	BD Biosciences	353143	BD Biosciences Hücre Kültürü - BD Falcon Multi-şişeler
5-katmanlı Doku Kültürü ile tedavi edilen 875cm 2	BD Biosciences	353144
100ml pipet	BD Biosciences	357600
10 ml pipet	BD Biosciences	357551
5 ml pipetle aspire	BD Biosciences	357.501
50 ml Polipropilen konik boru	BD Biosciences	352070
T-175 şişesi Doku Kültürü ile tedavi edilen	BD Biosciences	353028
Gram Kristal menekşe	BD	212525
DMEM	Invitrogen	11885
GMEM	Sigma	G5154
RPMI-1640	ATCC	30-2001
MEM	ATCC	30-2003
Tripsin-EDTA	Lonza	CC-5012
Fetal sığır serumu	Invitrogen	16000-044
Tryptose Fosfat broth	Sigma	T8159
BHK-21 hücre	Sigma	85011433
Hep-G2, LnCAP	ATCC
Ecopack 2-293	Clontech
Paraformaldehit	Elektron Mikroskopi Bilimleri	15710
Polistiren Boncuk	PolySciences Inc.	24628-20
Bio-Profil Flex Analyzer	Nova Biyomedikal