Расширение масштабов культуры клеток млекопитающих использованием новых многослойных Колба

Резюме

Клетки играют важную и все возрастающую роль в научных исследованиях, и открытие и разработку новых методов лечения. При этом растущая потребность в большем количестве клеток нам необходимо более эффективное и эффективные способы для выращивания и сбора урожая привязанности зависимые ячейки. Многослойные колбу с правом особенности могут служить этой цели.

Аннотация

Все большее число клеточных приложения требуют большого количества клеток. Использование одного слоя T-колб, которые являются адекватными во время мелкие расширения, может стать громоздким, трудоемким и длительным, когда большое количество клеток не требуется. Чтобы удовлетворить эту потребность, производительность новой многослойной судна культуры клеток для облегчения расширения клеток из одного слоистого T-колб будет обсуждаться. Колбы испытания доступны в 3 - и 5-слойная формат и включить культуру и полное восстановление три и пять раз превышает число клеток, соответственно, по сравнению с Т-175 флаконов. Ключевой особенностью BD Multi-колбе смесь / уравновешивания порт, который позволяет быстро, в-сосуд смешивания, а также равномерное распределение клеток и реагентов внутри и между слоями каждое судно и постоянно производить клетки, которые можно культивировать в среде, которая сравнимо с Т-175 флаконов.

Дизайн этих Multi-Колбы также позволяет сonvenient доступ пипетки для добавления реагентов и клеток непосредственно в колбах, а также эффективное восстановление ценных клеток и реагентов и уменьшает риск загрязнения в результате заливки. Для приложений, где проливной предпочтительнее, чем пипетки, конструкция позволяет минимальной остаточной удержанию жидкости в целях снижения потерь ценных клеток и реагентов.

протокол

1. Протокол использовать Multi-Колбы для клеточных культур

1. Подготовка судов и добавлением суспензии клеток
   1. Подготовка средний рост клеток по мере необходимости.
   2. Выстроить Multi-Колба вертикально на боку с крышкой вверх на рабочую поверхность (стерильные ламинарном боксе).
      1. Эти колбы доступны в 3 и 5-слойная форматов и использования подобной работы-картины течения, как T-175 колбу.
   3. Ослабить и снять шапки. Добавить необходимое количество подогретого среды в колбе с использованием 50 или 100 мл пипетки или путем заливки.
      1. Пипетки, которые ≤ 10 мл может достигать дна сосуда, когда на нескольких Колбы помещают вертикально с крышкой вверх. Пипетки ≥ 10 мл может достигать в сосуд сразу прошлом логотип на Multi-колбу, тем самым обеспечивая удобный портал для добавления большего объема средств массовой информации для судна.
   4. Чтобы избежать пузырьков среды, позволяют поток жидкости на этвл вдоль внутренней стенки Multi-колбу крышкой (логотип стороне).
   5. Добавить клеточной суспензии из концентрированного фондовом клетки в питательной среде через верхний слой с помощью 10 мл пипетки и крышка фляги.

      Советы:

      - Транспорт на нескольких контейнерах на корзину на сайте инкубатора и выполнить оставшиеся шаги.
      - Плотность клеток посева будет варьироваться в зависимости от типа клеток, средних и необходимости культуры продолжительности. Начните с плотностью посева и средств массовой информации объем, который используется в стандартной Т-175 колб и умножить на 3 или 5 в зависимости от Multi-Колба формат.

2. Смешивание клеток
   1. Смешайте позицию: Держите Multi-Колба вертикально с логотипом к себе и повернуть против часовой стрелки, чтобы под углом 45 ° с микс порт к себе.
   2. Холдинг под тем же углом, слегка наклонять Multi-Колба спереди назад (шея от себя), пока жидкость в верхнем слое стоков полностью downwarDS через смесь порт. Pivot на смесь левого борта.
   3. Точно так же осторожно встряхнуть Multi-колбу от задней стенки к передней (шеи по направлению к вам), пока средний стоков полностью от нижнего слоя к вершине через смесь порт. Повторите шаги 1.2.2 и 1.2.3 еще раз, чтобы обеспечить надлежащее смешивание.
   4. Принесите Multi-колбу обратно смешать позицию (шаг 1.2.1) и перейдите к шагу 1,3
   5. Кроме того, клеточная суспензия может быть подготовлен внешне от Multi-колбы и клеточной суспензии могут быть добавлены в сосуд с помощью пипетки или нежный заливки.
      1. Смешайте порт позволяет в сосуд смешивания клеток со средствами массовой информации и избавляет от необходимости делать большие объемы клеточные суспензии, внешне.
      2. Она также позволяет СМИ выравнивания поперек слоев Multi-Колба
3. Уравновешивание жидкости
   1. После смешивания / добавление суспензии клеток, место Multi-Колба вертикально на ровную рабочую поверхность для выравнивания объема жидкости уравнениеlly во всех слоях.
4. Раздела жидкость в каждом слое
   1. Держите Multi-Фляга с логотипом к себе и повернуть по часовой стрелке на 45 градусов для разделения жидкости в каждом из слоев.

      Совет:

      - Для достижения наилучших результатов, важно использовать ровную рабочую поверхность для Шаги 1.3-1.4

5. Транспорт
   1. После среды, содержащие суспензии клеток разбито, транспорт Multi-колбу, в то же углом 45 ° (по часовой стрелке), как в шаге 1.4.1 со средствами массовой информации от сочетания порта в инкубаторе. Эта позиция подходит также при извлечении колбы из инкубатора для просмотра на микроскоп.
6. Размещение нескольких колбу на полке инкубатора
   1. Холдинг Multi-колбу на 45 ° (по часовой стрелке, вдали от микс-порт), осторожно поверните его горизонтально на поверхность инкубатора (с использованием углу от смеси портвращения). Положите Multi-колба с логотипом вверх.
      1. Сокол Multi-Колба конструкция позволяет судам для штабелирования и удерживает их на месте с помощью надежное штабелирование ребра.
7. Распределение клеток и реагенты
   1. После размещения Multi-Колба квартира на рабочую поверхность, аккуратно рок вперед-назад и из стороны в сторону, чтобы распространять клетки равномерно на поверхности культуры, стараясь не пролить жидкость из каждого слоя. Стек колб.
      1. Это колба выполнена из оптически прозрачного материала и клеток на последний слой можно легко просматривать на микроскоп.
8. Медиа-обмен
   1. Аспирацию в то время как наклон Multi-Колба влево (смесь левого борта) с логотипом к себе.
   2. Затем наклон, Multi-Колба вправо, продолжая аспирации всех остаточных средств массовой информации.
   3. Добавить соответствующее количество средств массовой информации и выполните шаги 1.3-1.7

2.Сбор клетки Multi-Колбы

1. Чтобы отделить клетки, выстраиваются на нескольких колб вертикально и принести каждому из них Mix позицию (шаг 1.2.1). Аккуратно инвертировать колбы с шеи к себе с тем чтобы средства массовой информации отводится в верхний слой Multi-Flask.
2. Вставьте 5 или 10 мл аспирационных наконечник через шею, пока не достигнете уровня жидкости вблизи смесь порт. Аспирируйте исчерпаны среды.
3. Добавить диссоциации реагента / промывочного буфера и довести до Mix позиции, как в шаге 1.2.1, а затем приступить и выполните шаги 1.3-1.7. Нейтрализовать со средним ростом / нейтрализующим агентом и залить клеточной суспензии в приемной трубки или инвертировать колбу так, что клетки стекать Верхний слой судна и собрать клетки с помощью 10 мл пипетки.

   Совет: Для улучшения восстановления клеток или реагенты, довести Multi-Колба смешивать позицию (шаг 1.2.1), инвертировать с шеи по отношению к оператору, чтобы полный дренаж СМИ от др. л слоев для верхнего слоя. Затем наклоните Multi-колбу по часовой стрелке на 45 градусов (от сочетания порта), а Multi-Колба остается перевернутой. Используйте пипетку (1-10 мл), чтобы собрать все оставшиеся реактивы.

3. Рекомендуемый рабочий объем в Соколе Multi-Колбы

Рост средств массовой информации

3-слой: 75-150 мл на Multi-Колба
5-слой: 125-250 мл на Multi-Колба

Диссоциация агент

3-слой: ≥ 15 мл на Multi-Колба
5-слоя: ≥ 25 мл на Multi-Колба

Совет: Начните со средним объемом используется в стандартных Т-175 колб и умножить на 3 или 5 раз в зависимости от Multi-Колба формате оценивается таким образом, чтобы мл на единицу площади поверхности остается той же.

4. Представитель Результаты:

1. Дизайн Сокол Multi-Колба

files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/>
. Рисунок 1: Multi-Колба судов культуре клеток доступны в 3 - и 5-слойная стекируемых формат для расширения масштабов предоставления клетки 525 и 875 см ² площади поверхности роста, соответственно. Внесите доступа облегчает добавление и удаление клеток и реагентов в-и из сосуда. Наличие микс-порт позволяет быстро в сосуд смешивания и выравнивания СМИ во всех слоях Multi-Flask.

2. Сотовые Доходность использованием Multi-Колба:

Эти суда доступны в 3-слойный и 5-слойная форматов, которые соответствуют 3 и 5 раз площадь поверхности Т-175 флаконов. Соответственно, ≥ 3 и 5 раз (130 ± 6,8 х 10 ⁶ и 218 ± 23,6 х 10 ^{6 клеток,} соответственно) число ВНК-21 (ребенок почек хомяка) клетки были выращены и оправился от Multi-Колба по сравнению с Т-175 колбы (43,2 ± 3,5 х 10 ^{6 клеток;} рис.2а). Сотовые урожайность унит площадь была эквивалентна в 3 - и 5-слойная Multi-Колбы и Т-175 контейнеров для ВНК-21, LNCaP (аденокарциномы предстательной железы человека линии клеток), Нер-G2 (линии клеток человека гепатокарциномы), ECOPACK 2-293 (человека линии клеток почек) культивировали в течение периода 48-96ч (рис.2б) в питательной среде (35 мл на слой) в соответствии с рекомендациями по мобильному поставщика (АТСС, Sigma и / или Clontech). Клетки были перечислены на автоматизированных Vi-CELL счетчик ^(1).

Рисунок 2А: три и в пять раз число ВНК-21 клетки были выращены и оправился от 3 ​​- и 5-слойная Multi-Колбы по сравнению с Т-175 флаконов. Ожидаемая доходность определялась с помощью Средняя урожайность ячейки из-под контроля Т-175 колб, умноженному на три и в пять раз по 3 - и 5-слойная Multi-Колбы соответственно (п = 4 колб / формат).

/> Рисунок 2B: Сотовый выход на см ² была эквивалентна в 3 - и 5-слойная Multi-Колбы и Т-175 контейнеров для ВНК-21, LNCaP, HepG2 и EcoPack2-293 клеток. Каждая полоса представляет среднем от 4 до 6 колб. ВНК-21 клеток (11000 cells/cm2) культивировали в течение 72 часов, LNCaP клеток (20000 cells/cm2) и EcoPack2-293 клеток (~ 35000 cells/cm2) культивировали в течение 96 часов и HepG2 клетках (25 000 клеток / см ² ) культивировали в течение 48 часов до сбора урожая.

3. Медиа распределения между слоями Multi-Колба

Сотовые культуральной среде (DMEM; Invitrogen) был добавлен в 5-слойной Multi-колбы (250 mL/5-layer судна) и разбивается на слои в соответствии с протоколом, описанных выше. Медиа распределение измерялось сверления отверстий в каждом слое и СМИ откачивается из отдельных слоев. Вес жидкости оправился от каждого слоя оказалось относительно равномерным от слоя к слою, как показано на рис 3. Они заключаются в следующем: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (г).

Рисунок 3. Равномерное распределение средств массовой информации в каждой из пяти слоев 5-слойной Multi-Flask. Среду клеточной культуры был добавлен в Multi-колбы (250 ml/5-layer судна), уравновешенной и разделена на отдельные слои. СМИ откачивается через отверстия, просверленные в отдельных пластов и переход жидкости вес был зафиксирован из каждого слоя (п = 6 колб).

4. Сотовые распределения между слоями Multi-Колба

Клетки могут быть добавлены и смешанной в пределах нескольких Flask. Мы моделировали распределение клеток между слоями Multi-Колба использованием бисера (10 мкм; PolySciences Inc) близки по размерам к клеткам. Бусы суспензии добавляют в Multi-Колба судна с помощью 10 мл пипетки через верхний слой и смешанные со средствами массовой информации в сосуде, как по убываниюribed в протоколе выше. Бусы распределение измерялось сверления отверстий в каждом слое и жидкости, содержащей бусинку суспензия откачивается из отдельных слоев. Бусы концентрации оправился от каждого слоя было зачитано от счетчика Coulter и зарегистрированы. Ниже приведены эквивалентные межуровневых бусинка распределений в 3-х слойные Multi-колбы (рис.4а). Микс-порт дает возможность равномерного распределения клеток и реагентов между Multi-Колба слоев.

Рисунок 4а: Bead распределения в каждой из трех слоев 3-слойный Multi-Flask. Подвески из бисера (3,6 х10 ⁶ / мл) добавляют к среде разливали в Multi-колбы (шарик подвеска: медиа объем составляет 1:10, т.: т.) и смешанные, а затем равновесия и разделов действия, используя протокол, описанный. Бусы концентрации оправился от каждого слоя (перекачиваемой жидкости через отверстия, просверленные на каждом слое) было зачитано от Coulter графаэр и зарегистрированы. Ниже приведены эквивалентные межуровневых бусинка распределений в 3 - слой Multi-колбы (п = 5 колб)

Ниже приведены представитель образы Ecopack 2-293 окрашивания моделей клеток, выращенных на> 80% от слияния 3-х слойные Multi-Колбы в средствах массовой информации дополнены роста. Сотовые монослои фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым и мульти-Колба слои затем вырезать и отсканированные изображения ^(2). Обратите внимание, сотовые структурирование была однородной по всем слоям Multi-Колба (Fig.4B). Аналогичные результаты были получены с несколькими типами клеток оценивали (данные не представлены).

Рис 4B: Этот рисунок иллюстрирует однородные роста клеток между слоями Multi-колбы. Ecopack-2-293 клеток, выращенных на> 80% слияния в 3-х слойные Multi-Колбы и Т-175 были зафиксированы и окрашивали фиолетовый кристалл. Multi-Колба суда были вырезаны, и каждый окрашенный слой был отсканирован.

5 Подача воздуха в Multi-Flask.:

Анализ провел носитель с помощью BioProfile FLEX анализатор ^(3,4) (Nova биомедицинских) от EcoPack2-293 клетки культивировали в течение 96 часов не выявили различий в воздухе насыщение клеток, выращенных в 5-слойной Multi-Колбы по сравнению с Т-175 колб (81,03 ± 1,9 против 83,4 ± 5,8% окружающего O _2).

Рисунок 5: Air насыщения (% окружающего O ₂₎ отработанного СМИ были одинаковыми в предварительно смешанных средств массовой информации из 5-слойной Multi-Колбы по сравнению с Т-175 флаконов. EcoPack2-293 клетки высевали при плотности 35000 клеток / см ² и культивировали в течение 96 часов до анализа СМИ (п = 3 фляги).

Обсуждение

Данное исследование демонстрирует увеличение производительности, что Multi-Колба дизайн предлагает исследователям. Хотя важно следовать шаги, описанные выше, для достижения оптимальной производительности при использовании Multi-Колбы, Есть несколько важных шагов в этом протоколе, которые считаются наиболее существенными. К ним относятся (я) смешивание клеток и реагенты использованием смеси порт в сосуд (II) транспортировки Multi-колбу на 45 ° по часовой стрелке после перегородки жидкости в каждом из слоев (III), укладка Multi-Колба плоские разбиения на сообщение инкубатора.

Правильное использование Multi-колба приводит к производству однородной популяции клеток внутри каждого судна, которое культивировали в среде, которая сравнима с Т-175 колб ^(5). Эти суда предоставить 3 и 5 раз больше клеток в аналогичный след, как T-175 колбу. 3 и 5-слойная судна обеспечивает 525 и 875cm ² роста области, соответственно, и предлагают как пространство и труда сavings для пользователей. Тканевой культуры Обработка поверхности сравнима с колбами стандартного что позволяет масштабов без необходимости повторной оптимизации существующих условиях культуры или ущерба для качества, однородности или производительность клеток ^{(6, 7).} Это также обеспечивает сопоставимость с ранее собранными данными. Эти суда могут быть также покрыта реагентов, таких как коллаген, фибронектин, поли-D-лизина предоставить специализированные субстратом для прикрепления, роста и дифференциации определенных типов клеток, таких как гепатоциты ^{8, 9} kertainocytes, стволовые клетки, выращенные в бессывороточной СМИ формулировках. Покрытие решения могут быть удалены с минимальной остаточной удержанию жидкости в целях снижения потерь ценных реагентов, а также эффективное удаление раствор для покрытия до культивирования клеток. Рекомендуется оптимальный объем средств массовой информации к культуре клеток в нескольких колб от 0.142-0.287 мл / см ^2, которые переводят на 25-50 мл на один слой. В отличие от другого многослойные колбу, тсвой продукт предлагает микс-порт судно, которое позволяет быстро, в-сосуд смешивания, а также равномерное распределение клеток и реагентов внутри и между слоями каждого судна. Разнообразные клеточные линии, первичных культур и стволовые клетки были расширены эффективного использования Multi-колбы. Эти сосуды особенно выгодно в приложениях, требующих большого количества клеток, например, в высокой пропускной способности отбор, производство вакцин, вирусной трансфекции вектора и клеточной терапии.

Экономия времени, пространства, труда и снижение отходов являются ключевыми выигрыш Multi-Колба по сравнению с обычными культурами в однослойных сосудах. Мы можем культуры примерно в три раза превышает число клеток, полученных из 5, Т-175 колб в том же пространстве, используя 3, 5-слоя Multi-колбы. Это преимущество в экономии пространства, не ограничивается только на Т-175, но может быть распространено и на другие суда: стандартный аппарат бутылки ролик, который вписывается в общие лабораторные инкубаторы домов ~ 4 ROLлер бутылки (2200 мл), каждый из которых обеспечивает 850cm ² площади поверхности. В этом же районе, ~ 20, 5-слойной Multi-Колбы могут быть размещены таким образом обеспечивая пятикратный рост поверхности к культуре клеток. Кроме того, с увеличением "Go-зеленой" общественности, что позволит уменьшить образование отходов является весьма желательным. В этом отношении, есть 38% (5, Т-175 колб весом ~ 640G в то время как один, 5-слойной Multi-Колба весит ~ 400 г) уменьшение образования отходов использованием Multi-Колбы по сравнению с Т-175 колб и эти преимущества ведут к снижению хранения и захоронения отходов затрат и привести к экономии средств для пользователя.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента / Оборудование	Компания	Catalogue #	Комментарии
3-слойная тканевой культуры обработанных 525cm 2	BD Biosciences	353143	BD Biosciences культуре клеток - BD Сокол Multi-Колбы
5-слойная тканевой культуры обработанных 875cm 2	BD Biosciences	353144
100 мл пипетки	BD Biosciences	357600
10 мл пипетки	BD Biosciences	357551
5 мл аспирационной пипетки	BD Biosciences	357501
50 мл полипропиленовые конической трубе	BD Biosciences	352070
Т-175 колбу тканевой культуры обработанных	BD Biosciences	353028
Грамм Crystal Violet	BD	212525
DMEM	Invitrogen	11885
GMEM	Сигма	G5154
RPMI-1640	АТСС	30-2001
MEM	АТСС	30-2003
Трипсин-EDTA	Lonza	CC-5012
Эмбриональной бычьей сыворотки	Invitrogen	16000-044
Tryptose фосфат Отвар	Сигма	T8159
ВНК-21 клетки	Сигма	85011433
Hep-G2, LNCaP	АТСС
Ecopack 2-293	Clontech
Параформальдегид	Электронная микроскопия наук	15710
Полистирол бисера	PolySciences ООО	24628-20
Bio-Flex профиля Analyzer	Нова биомедицинских