Scale Up de Cultura de células de mamíferos utilizando um Flask New Multicamadas

Resumo

Células desempenham um papel fundamental e crescente na pesquisa e na descoberta e desenvolvimento de novas terapêuticas. Com esta crescente necessidade de maior número de células que precisam de maneiras mais eficientes e eficazes para o cultivo e colheita de células apego dependente. Um frasco de múltiplas camadas com as características certas pode servir a esse propósito.

Resumo

Um número crescente de aplicações baseadas em células requerem um grande número de células. Utilização de camada única T-frascos, que são adequados durante a pequena escala de expansão, pode tornar-se complicado, trabalhoso e demorado quando um grande número de células são obrigatórios. Para atender a essa necessidade, o desempenho de um novo navio cultura multi-camadas de células para facilitar escala fácil de células da camada única T-frascos serão discutidos. Os frascos testados estão disponíveis em 3 - e 5-camada formato e permitir que a cultura ea recuperação completa de três e cinco vezes o número de células, respectivamente, em comparação com T-175 frascos. Uma característica chave do BD Flask Multi-é uma porta de mix / equilíbrio que permite rápida em recipiente de mistura, bem como distribuição uniforme de células e reagentes dentro e entre as camadas de cada navio e consistentemente produzem células que podem ser cultivadas em um ambiente que é congruente a T-175 frascos.

O projeto destes frascos Multi-também permite cacesso pipeta onvenient para adicionar reagentes e células diretamente no frasco, bem como a recuperação eficiente de células valiosas e reagentes e reduz o risco de contaminação devido a vazamento. Para aplicações onde o vazamento é preferível a pipetagem, o projeto permite a retenção de líquido residual mínima, de modo a reduzir o desperdício de valiosas células e reagentes.

Protocolo

1. Protocolo a ser usado Multi-Frascos para cultura de células

1. Preparação dos vasos e adição de suspensão de células
   1. Prepare meio de crescimento celular, conforme necessário.
   2. Line up multi-Flask verticalmente em seu lado com a tampa virada para cima na superfície de trabalho (capela de fluxo laminar estéril).
      1. Estes estão disponíveis em frascos de 3 e 5 camadas formatos e usar um padrão de fluxo de trabalho semelhante a um balão de T-175.
   3. Solte e remova as tampas. Adicionar a quantidade necessária de pré-aquecido médio em frasco utilizando uma pipeta de 50 ou 100 mL ou por vazamento.
      1. Pipetas que são ≤ 10 ml pode chegar ao fundo do vaso quando Multi-Frascos são colocados verticalmente, com tampa virada para cima. Pipetas ≥ 10ml possa chegar até o navio imediatamente após o logotipo no Flask Multi-, proporcionando assim um portal conveniente para adicionar maiores volumes de mídia para navio.
   4. Para evitar bolhas de meio, permitir fluxo de líquido para flow ao longo da parede interna da tampa multi-Flask (logo-side).
   5. Adicionar suspensão celular a partir de um estoque de células concentrados em meio de crescimento através da camada superior usando uma pipeta de 10 mL e frascos cap.

      Dicas:

      - Transporte Multi-Frascos em um carrinho para o site incubadora e executar as etapas restantes.
      - A densidade de semeadura de células irá variar dependendo do tipo de célula, médio e precisam duração cultura. Comece com a densidade de semeadura e volume de mídia ao usado no padrão T-175 frascos e multiplicar por 3 ou 5, dependendo do Flask Multi-formato utilizado.

2. Mistura de células
   1. Mix posição: Segure o Flask Multi-ereto com o logotipo voltado para você e vire anti-horário para um ângulo de 45 ° com a porta mix voltado para você.
   2. Exploração no mesmo ângulo, incline ligeiramente Multi-Flask da frente para trás (pescoço longe de você) até que o líquido na camada superior drena totalmente downwards através da porta mix. Pivot no mix porta lateral.
   3. Da mesma forma, agite levemente Flask Multi-de trás para frente (pescoço para você) até meio ralos plenamente da camada inferior para a parte superior através da porta mix. Repita os passos 1.2.2 e 1.2.3 mais uma vez para assegurar a mistura adequada.
   4. Traga Multi-Flask de volta à posição mix (Passo 1.2.1) e prossiga para a Etapa 1,3
   5. Alternativamente, suspensão de células podem ser preparados externamente a partir do Flask Multi-e suspensão de células pode ser adicionado ao recipiente utilizando uma pipeta ou por gentil vazamento.
      1. Porta permite misturar em recipiente de mistura de células com a mídia e elimina a necessidade de grandes volumes de células em suspensão externamente.
      2. Ele também permite equalização de mídia em todas as camadas da Flask Multi-
3. Equilíbrio de fluidos
   1. Depois de misturar / adição de suspensão de células, coloque Flask Multi-verticalmente sobre uma superfície de trabalho plana para equalizar o volume de líquido equally em todas as camadas.
4. Líquido partição em cada camada
   1. Segure o frasco Multi-com o logotipo voltado para você e gire no sentido horário para um ângulo de 45 ° para particionar o líquido para cada uma das camadas.

      Dica:

      - Para melhores resultados, é importante o uso de uma superfície de trabalho apartamento em Passos 1,3-1,4

5. Transporte
   1. Uma vez que a mídia contendo suspensão de células é particionado, transporte Flask Multi-na mesma 45 ° de ângulo (sentido horário) como no Passo 1.4.1 com a mídia longe do porto mix em incubadora. Esta posição também é adequado ao remover frascos de incubadora para a visualização de um microscópio.
6. Colocando Multi-Flask em incubadora prateleira
   1. Segurando Multi-Flask no ângulo de 45 ° (sentido horário, longe da porta-mix), gentilmente gire-o para baixo horizontalmente na superfície incubadora (usando o canto longe do porto como um mixpivot). Lay Multi-Frasco com logotipo voltado para cima.
      1. Falcon design Multi-Flask permite que navios a serem empilhados e os mantém no lugar por uma costela resistente empilhamento.
7. Distribuição das células e reagentes
   1. Depois de colocar Multi-Flask sobre uma superfície plana de trabalho, gentilmente rock e para trás e para os lados para distribuir uniformemente as células em superfícies de cultura de tomar cuidado para não derramar líquido de cada camada. Pilha de frascos.
      1. Este balão é feito de material translúcido e células sobre a última camada pode ser facilmente visualizado em um microscópio.
8. Media Exchange
   1. Aspirar enquanto inclinando Flask Multi-o para a esquerda (mistura de porta-side) com o logotipo voltado para você.
   2. Em seguida, incline o frasco Multi-à direita, continuando a aspirar todos os meios de comunicação residual.
   3. Adicionar a quantidade apropriada de mídia e siga as etapas 1,3-1,7

2.Colheita de células multi-Frascos

1. Dissociar células, line up Multi-Frascos verticalmente e levar cada um a posição Mix (Passo 1.2.1). Inverta suavemente frascos com pescoço de frente para você, de modo a permitir que a media de drenagem para a camada superior da Multi-Flask.
2. Inserir um 5 ou 10 mL ponta de aspiração através do pescoço até chegar a nível de líquido perto do porto mix. Aspirar meio esgotado.
3. Adicionar dissociação tampão reagente / lavar e trazer para Mix posição como no Passo 1.2.1, então prossiga e siga os passos de 1,3-1,7. Neutralize com meio de crescimento / agente neutralizante e despeje suspensão de células em um tubo de receber ou inverter frasco de modo que as células de drenagem para a camada superior do navio e recolher as células usando uma pipeta de 10 mL.

   Dica: Para aumentar a recuperação de células ou reagentes, trazer Multi-Flask para misturar posição (Passo 1.2.1), inverta com o pescoço para operador para permitir a drenagem completa de mídia da Al l camadas para a camada superior. Então, Flask Multi-inclinação no sentido horário para ângulo de 45 ° (longe da porta mix) enquanto o Flask Multi-permanece invertida. Use uma pipeta (10-10 mL) para coletar os reagentes restantes.

3. Recomenda volume de trabalho na Falcon Multi-Frascos

Meio de crescimento

3-Layer: 75-150 mL por Multi-Flask
5-Layer: 125-250 mL por Multi-Flask

Dissociação agente

Layer-3: ≥ 15 mL por Multi-Flask
5-Layer: ≥ 25 mL por Multi-Flask

Dica: Comece com um volume de meio utilizado no padrão T-175 frascos e multiplicar por 3 ou 5 vezes, dependendo do Flask multi-formato avaliados para que mL por unidade de superfície continua a mesma.

4. Resultados representativos:

1. Projeto de Falcon Flask Multi-

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. Figura 1: Flask Multi-Cultura de Células embarcações estão disponíveis em uma 3 - e 5-camada formato empilhável para scale-up de células fornecendo 525 e 875 cm ² de superfície de crescimento, respectivamente. Pipeta de acesso facilita a adição e remoção de células e reagentes em e fora do navio. Presença de port-mix permite rápida em recipiente de mistura e equalização de media em todas as camadas da Multi-Flask.

2. Rendimento das células usando multi-Flask:

Estas embarcações estão disponíveis em 3 camadas e 5 camadas formatos que correspondem a 3 e 5 vezes a área da superfície da T-175 frascos. Assim, ≥ 3 e 5 vezes (130 ± 6,8 x 10 ⁶ e 218 ± 23,6 x 10 ⁶ células, respectivamente) o número de BHK-21 (baby hamster kidney), as células foram cultivadas e se recuperou de Multi-Flask comparado a T-175 frascos (43,2 ± 3,5 x 10 ⁶ células; Fig.2A). Rendimento celular por unit área de superfície era equivalente em 3 - e 5-Multi-camada de frascos e T-175 frascos para BHK-21, LNCaP (humanas da próstata linhagem celular de adenocarcinoma), Hep-G2 (linha celular humana hepatocarcinoma), Ecopack 2-293 (humanos linhagem de células renais) cultivadas por um período de 48-96h (Fig.2B) em meio de crescimento (35 ml por camada), como recomendado pelo fornecedor de células (ATCC, Sigma e / ou Clontech). As células foram enumeradas em um contador de Vi-CELL automatizado ^(1).

Figura 2A: três e cinco vezes o número de células BHK-21 foram cultivadas e se recuperou de 3 - e 5-layer Multi-Frascos em relação ao T-175 frascos. Rendimento esperado foi determinado utilizando rendimento celular média do controle T-175 frascos multiplicado por três e cinco vezes para a 3 - e 5-layer Multi-Frascos, respectivamente (n = 4 frascos / formato).

Figura 2B: rendimento das células por cm ² foi equivalente em 3 - e 5-Multi-camada de frascos e T-175 frascos para BHK-21, LNCaP, HepG2 e EcoPack2-293 células. Cada barra representa média de 4-6 frascos. Células BHK-21 (11.000 cells/cm2) foram cultivadas por 72 horas, as células LNCaP (20.000 cells/cm2) e EcoPack2-293 células (~ 35.000 cells/cm2) foram cultivadas por 96 horas e HepG2 células (25.000 células / cm ² ) foram cultivadas por 48 horas antes da colheita.

3. Distribuição de mídia entre camadas de Multi-Flask

Meio de cultura de células (DMEM; Invitrogen) foi adicionado em 5 camadas Multi-Frascos (250 mL/5-layer navio) e dividida em camadas de acordo com protocolo descrito acima. Distribuição de mídia foi medido por furos em cada camada e mídia bombeado para fora de camadas individuais. Peso de líquido recuperado de cada camada foi encontrado para ser relativamente uniforme de camada a camada, como mostrado na Figura 3. Eles são os seguintes: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gm).

Figura 3. Uniform distribuição de mídia em cada uma das cinco camadas de uma camada de 5-Multi-Flask. Meio de cultura celular foi adicionado em Multi-Frascos (250 navio ml/5-layer), equilibrada e dividida em camadas individuais. A mídia foi bombeado para fora através de buracos perfurados em camadas individuais e peso líquido foi gravado a partir de cada camada (n = 6 frascos).

4. Distribuição celular entre as camadas de Multi-Flask

As células podem ser adicionados e misturados dentro da Multi-Flask. Nós distribuição simulada de células entre as camadas de Multi-Flask usando pérolas (10μm; PolySciences Inc.), semelhante em tamanho às células. Suspensão de esferas foi adicionado em Multi-Flask navio utilizando uma pipeta de 10 mL através da camada superior e misturado com a mídia no vaso como described no protocolo acima. Distribuição de talão foi medido por furos em cada camada e fluido contendo suspensão de esferas foi bombeado para fora de camadas individuais. Concentração talão recuperado de cada camada foi lido em um contador Coulter e registrados. Mostrado a seguir são equivalentes inter-layer distribuições talão em 3 camadas Multi-Frascos (Fig.4A). A mistura de porta-permite a distribuição homogênea de células e reagentes entre Flask Multi-camadas.

Figura 4A: distribuição do grânulo em cada uma das três camadas de uma camada de 3-Multi-Flask. Uma suspensão de grânulos (3,6 x10 ⁶ / ml) foi adicionado ao meio dispensada em Multi-Frascos (suspensão de esferas: volume de mídia é 1:10, vol: vol) e mistos, seguido pelo equilíbrio e as etapas de partição utilizando o protocolo descrito. Concentração talão recuperado de cada camada (meio bombeado através de furos em cada camada) foi lido em uma contagem Coulterer e registrados. Mostrado a seguir são equivalentes inter-layer distribuições talão em 3 - Multi-layer Frascos (n = 5 frascos)

Mostrados abaixo são imagens representativas de Ecopack 2-293 padrões de coloração de células cultivadas em> confluência de 80% em 3 camadas de Multi-Frascos em meios de crescimento suplementado. Monocamadas de células foram fixadas e coradas com cristal violeta e Multi-camadas Flask foram então cortadas e imagens digitalizadas ^(2). Nota padronização celular, foi homogênea em todas as camadas da Flask-Multi (Fig.4B). Resultados semelhantes foram obtidos com vários tipos de células avaliados (dados não mostrados).

Figura 4B: Esta figura ilustra o crescimento de células homogêneas entre as camadas de Multi-Frascos. Ecopack-2-293 células cultivadas a> confluência de 80% em 3-Multi-camada de frascos e T-175 foram fixados e corados com violeta de cristal. Multi-Flask vasos foram cortados e cada camada manchada foi digitalizada.

5 Air oferta em Flask-Multi.:

Análise de media gasto com BioProfile FLEX analisador ^(3,4) (Nova Biomedical) de EcoPack2-293 células cultivadas por 96 horas não revelou nenhuma diferença na saturação do ar de células cultivadas em 5 camadas Multi-Frascos vs T-175 frascos (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% ambiente O _2).

Figura 5: Air saturação (% ambiente O ₂₎ dos meios de comunicação passaram foram semelhantes em pré-mixed media de 5 camadas Multi-Frascos vs T-175 frascos. EcoPack2-293 células foram semeadas a uma densidade de 35.000 células / cm ² e cultivadas por 96 horas antes da análise de media (n = 3 frascos).

Discussão

O presente estudo demonstra o aumento da produtividade que a concepção Flask Multi-oferece aos pesquisadores. Embora seja importante seguir as etapas descritas anteriormente para desempenho otimizado ao usar Multi-Frascos, há poucos passos críticos neste protocolo que são considerados mais essenciais. Estes incluem: (i) mistura de células e reagentes usando a porta mix dentro do vaso (ii) o transporte de Multi-Flask em um ângulo de 45 ° no sentido horário após particionamento líquido para cada uma das camadas (iii) que Flask-Multi pós plano de particionamento para o incubadora.

Uso adequado de Multi-Flask leva à produção de uma população de células homogêneas dentro de cada navio que é cultivada em um ambiente que é congruente a T-175 frascos ^(5). Estas embarcações fornecer células 3 e 5 vezes mais em um espaço semelhante ao do frasco T-175. O navio 3 e 5 camadas fornece 525 e 875 centímetros ² de área de crescimento, respectivamente, e oferecem espaço e trabalho savings para os usuários. Tratamento de superfície de tecido Cultura é comparável ao padrão frascos permitindo scale-up, sem a necessidade de re-otimização das condições de cultura existente ou comprometer a homogeneidade, qualidade ou desempenho de células ^{(6, 7).} Isto também prevê a comparabilidade com os dados coletados anteriormente. Esses vasos podem ser também revestido com reagentes tais como colágeno, fibronectina, poli-D-lisina para fornecer um substrato para o crescimento especializados apego e diferenciação de certos tipos de células, tais como hepatócitos ^{8, 9} kertainocytes, células-tronco cultivadas em soro de mídia livre formulações. Soluções de revestimento pode ser removido com a retenção de líquido residual mínima, de modo a reduzir o desperdício de reagentes valiosos, bem como a remoção eficaz de solução de revestimento antes de a cultura de células. O recomendado volume de mídia ideal para células de cultura em frascos multi-faixa ,142-0,287 ml / cm ^2, que se traduzem em 25-50 ml por camada. Ao contrário de um outro frasco de múltiplas camadas, tseu produto oferece uma combinação porta-in que permite que a embarcação rápida no vaso de mistura, bem como distribuição uniforme de células e reagentes dentro e entre as camadas de cada navio. Linhagens de células diversas, culturas primárias e células-tronco foram ampliados de forma eficiente usando Multi-Frascos. Estes navios são particularmente vantajoso em aplicações que exigem um grande número de células, como no alto throughput screening, a produção de vacinas, transfections vetor viral e terapia celular.

Economia de tempo, espaço, trabalho e geração de resíduos são reduzidos ganhos chave do Flask multi-versus culturas convencionais em vasos de camada única. Podemos cultura cerca de três vezes o número de células colhidas de 5, T-175 frascos no mesmo espaço, com 3, 5 camadas Multi-Frascos. Esta vantagem na economia de espaço não se limita apenas a T-175, mas também pode ser estendido para outros navios: um aparelho de garrafa padrão rolo que se encaixa em incubadoras de casas comuns de laboratório rol ~ 4garrafas de Ler (2200 ml) cada um dos quais fornece 850 centímetros ^{2 de} superfície. Na mesma área, ~ 20, 5 camadas Multi-Frascos podem ser alojados proporcionando assim cinco vezes a superfície de crescimento para células de cultura. Além disso, com um aumento do "Go-Green" consciência, opções para reduzir a geração de resíduos é altamente desejável. A esse respeito, há um 38% (5, T-175 frascos pesam ~ 640g enquanto que uma, Flask Multi-5 camadas pesa ~ 400g) diminuição da geração de resíduos utilizando Multi-Frascos em relação ao T-175 frascos e levar essas vantagens a diminuir em armazenamento dos resíduos e custos de eliminação e resultar em economia de custos para o usuário.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / Equipamentos	Companhia	Catálogo #	Comentários
3 camadas de cultura de tecidos tratados com 525 centímetros 2	BD Biosciences	353143	BD Biosciences Cultura de Células - BD Falcon Multi-Frascos
5 camadas da cultura de tecidos tratados 875 centímetros 2	BD Biosciences	353144
100ml pipeta	BD Biosciences	357600
10 ml de pipeta	BD Biosciences	357551
5 ml de aspiração pipeta	BD Biosciences	357501
50 tubo de polipropileno ml cônico	BD Biosciences	352070
T-175 Tecido frasco Cultura tratados com	BD Biosciences	353028
Gram Cristal Violeta	BD	212525
DMEM	Invitrogen	11885
GMEM	Sigma	G5154
RPMI-1640	ATCC	30-2001
MEM	ATCC	30-2003
Tripsina-EDTA	Lonza	CC-5012
Soro fetal bovino	Invitrogen	16000-044
Triptose fosfato Caldo	Sigma	T8159
Células BHK-21	Sigma	85011433
Hep-G2, LNCaP	ATCC
Ecopack 2-293	Clontech
Paraformaldeído	Microscopia Eletrônica de Ciências	15710
Bead poliestireno	PolySciences Inc.	24628-20
Bio-Flex Profile Analyzer	Nova BioMedical