La ampliación de los cultivos celulares de mamíferos con un frasco de varias capas de Nueva

Resumen

Células juegan un papel fundamental y creciente en la investigación y el descubrimiento y desarrollo de nuevos tratamientos. Con esta creciente necesidad de un mayor número de células que necesitamos maneras más eficientes y eficaces para el cultivo y la recolección de células apego dependiente. Un matraz de múltiples capas con las características adecuadas puede servir para este propósito.

Resumen

Un número creciente de aplicaciones basadas en Cell requieren grandes cantidades de células. El uso de una sola capa frascos T, que son adecuadas en pequeña escala, la expansión, puede llegar a ser complicado, laborioso y requiere mucho tiempo, cuando un gran número de células se necesitan. Para satisfacer esta necesidad, la realización de un nuevo multi-capas recipiente de cultivo de células para facilitar la escala fácil de las células de capa única frascos T serán discutidos. Los frascos de prueba están disponibles en 3 - y el formato de 5 capas y permitir la recuperación de la cultura y completa de tres y cinco veces el número de células, respectivamente, en comparación con el T-175 frascos. Una característica clave de la BD Multi-frasco es un puerto de mezcla / de equilibrio que permite una rápida en recipiente de mezcla, así como una distribución uniforme de las células y los reactivos dentro y entre las capas de cada buque y constantemente producen las células que pueden ser cultivados en un ambiente que es congruente con el T-175 frascos.

El diseño de estos frascos multi-también permite cacceso pipeta onvenient para la adición de reactivos y las células directamente en los frascos, así como la recuperación eficiente de valiosas células y los reactivos y reduce el riesgo de contaminación por el vertido. Para aplicaciones donde se prefiere verter más de pipeteado, el diseño permite una retención mínima de líquido residual con el fin de reducir el desperdicio de valiosas células y los reactivos.

Protocolo

1. Protocolo para el uso de varios frascos de cultivo celular

1. Preparación de los buques y la adición de la suspensión de células
   1. Preparar el medio de crecimiento de las células según sea necesario.
   2. Alinee Multi-frasco vertical sobre su lado con la tapa hacia arriba sobre la superficie de trabajo (campana estéril de flujo laminar).
      1. Estos frascos están disponibles en tres formatos y de 5 capas y el uso de un similar patrón de flujo de trabajo como un frasco T-175.
   3. Aflojar y remover las tapas. Añadir la cantidad necesaria de pre-calentado medio en un matraz con una pipeta de 50 o 100 ml o por infusión.
      1. Pipetas que son ≤ 10 ml puede llegar al fondo de la vasija, cuando varios frascos se colocan verticalmente con la tapa hacia arriba. ≥ 10 ml pipetas pueda llegar hasta el buque inmediatamente pasado el logotipo en el frasco de Multi-, proporcionando así un portal conveniente de añadir un mayor volumen de medios de comunicación para los buques.
   4. Para evitar la propagación del medio, permiten flujo de líquido a flómo lo largo de la pared interna de la tapa del Multi-frasco (logo-lado).
   5. Añadir suspensión celular de una reserva de células concentradas en un medio de crecimiento a través de la capa superior con una pipeta de 10 ml y frascos de tapa.

      Consejos:

      - Transporte Multi-frascos en un carro al sitio de la incubadora y realizar los pasos restantes.
      - La densidad de siembra de células puede variar dependiendo del tipo de célula, media y duración de la cultura necesita. Comience con la densidad de siembra y el volumen de los medios de comunicación al que se utiliza en el estándar T-175 frascos y se multiplica por 3 o 5 en función del frasco de Multi-formato utilizado.

2. La mezcla de células
   1. Mix posición: Sostenga el frasco en posición vertical Multi-con el logotipo de frente a usted y a su vez hacia la izquierda a un ángulo de 45 ° con el puerto de mezcla frente a usted.
   2. La celebración en el mismo ángulo, con cuidado de inclinación Multi-frasco de adelante hacia atrás (en el cuello lejos de usted) hasta que el líquido en la capa superior drena totalmente downwards a través del puerto de mezcla. Giran en torno a la mezcla de babor.
   3. Del mismo modo, agite suavemente Multi-frasco de atrás hacia adelante (el cuello hacia usted) hasta que esté medio drena por completo de la capa de abajo hacia arriba a través del puerto de mezcla. Repita los pasos 1.2.2 y 1.2.3, una vez más para asegurar una mezcla adecuada.
   4. Lleva Multi-frasco de nuevo a la posición de mezcla (paso 1.2.1) y vaya al paso 1.3
   5. Por otra parte, la suspensión de células se pueden preparar externa del frasco Multi-y la suspensión de células se puede agregar a la embarcación con una pipeta o suave vertido.
      1. Puerto de combinación permite en recipiente de mezcla de células con los medios de comunicación y elimina la necesidad de hacer grandes cantidades de células en suspensión externa.
      2. También permite la igualdad de medios a través de las capas de la Multi-frasco
3. El equilibrio de fluidos
   1. Luego de mezclar / adición de la suspensión celular, lugar Multi-frasco vertical sobre una superficie plana para igualar el volumen de líquido ecuaciónlly en todas las capas.
4. Separación líquido en cada capa
   1. Sostenga el frasco de Multi-con el logotipo hacia arriba y gire hacia la derecha a un ángulo de 45 ° a la partición del líquido en cada una de las capas.

      Consejo:

      - Para obtener mejores resultados, es importante utilizar una superficie plana para los pasos 1.3-1.4

5. Transporte
   1. Una vez que los medios de comunicación que contiene la suspensión de células se divide, transporte Multi-frasco en el mismo ángulo de 45 ° (a la derecha) como en el paso 1.4.1 con los medios de comunicación del puerto mezcla en incubadora. Esta posición también es adecuado cuando la eliminación de frascos de la incubadora para su visualización en un microscopio.
6. La colocación de Multi-frasco en incubadora útil
   1. La celebración de Multi-frasco en el ángulo de 45 ° (a la derecha, lejos de la mezcla de un puerto), gire suavemente hacia abajo en posición horizontal en la superficie de la incubadora (utilizando la esquina del puerto como una mezclapivote). Coloque Multi-frasco con el logotipo hacia arriba.
      1. Falcon Multi-frasco de diseño permite a los barcos que se apilan y se las mantiene en su lugar por una costilla resistente de apilamiento.
7. Distribución de células y los reactivos
   1. Después de la colocación de Multi-frasco de planos en la superficie de trabajo, con suavidad hacia adelante y atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente sobre las superficies de las células de la cultura teniendo cuidado de no derramar el líquido de cada capa. Pila de frascos.
      1. Este frasco es de un material ópticamente transparente y las células de la última capa se pueden ver fácilmente en un microscopio.
8. Medios de intercambio
   1. Aspirar mientras se inclina el frasco Multi-a la izquierda (mezcla de babor) con el logotipo hacia usted.
   2. A continuación, la inclinación, el frasco de Multi-a la derecha, sigue aspirar todos los medios de comunicación residual.
   3. Agregue la cantidad adecuada de los medios de comunicación y siga los pasos 1.3-1.7

2.La recolección de células multi-Frascos

1. Para disociar las células, se alinean varios frascos vertical y llevar a cada uno a la mezcla de posición (paso 1.2.1). Invierta suavemente frascos con cuello de frente a usted a fin de que los medios de comunicación para drenar la capa superior de la Multi-Flask.
2. Inserte un 5 o 10 ml de la punta de aspiración a través del cuello hasta llegar a nivel de líquido cerca del puerto de mezcla. Aspirar medio agotado.
3. Añadir disociación reactivo / tampón de lavado y llevar a la posición de la mezcla como en el paso 1.2.1, a continuación, proceder y seguir los pasos 1.3 a 1.7. Neutralizar con medio de cultivo / agente de neutralización y se vierte la suspensión de células en un tubo receptor o invertir frasco de manera que las células de drenaje para la capa superior de la nave y recoger las células con una pipeta de 10 ml.

   Consejo: Para mejorar la recuperación de las células o de los reactivos, llevar Multi-frasco para mezclar la posición (paso 1.2.1), invertir con el cuello hacia el operador para permitir el drenaje completo de los medios de comunicación de Al l capas de la capa superior. Luego, incline Multi-frasco de las agujas del reloj a 45 º (distancia desde el puerto de mezcla), mientras que el frasco de Multi-sigue siendo invertida. Utilice una pipeta (1-10 ml) para recoger el resto de los reactivos.

3. Volumen de trabajo recomendado en Falcon Multi-Frascos

Medios de cultivo

3-Capa: 75-150 ml por Multi-frasco
5-Capa: 125-250 ml por Multi-frasco

La disociación del agente

3-Capa: ≥ 15 mL por Multi-frasco
5-Capa: ≥ 25 ml por frasco de Multi-

Sugerencia: Comience con un volumen de medio utilizado en la norma T-175 frascos y se multiplica por 3 o 5 veces dependiendo del frasco de Multi-formato de evaluación para que ml por unidad de superficie sigue siendo el mismo.

4. Los resultados representativos:

1. Diseño de Falcon Multi-frasco

files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/>
. Figura 1: Multi-frasco de cultivo celular barcos están disponibles en 3 - y 5-capa formato apilable para ampliación de las células proporcionando 525 y 875 cm ^{2 de} superficie de crecimiento, respectivamente. Pipeta de acceso facilita la adición y la eliminación de las células y los reactivos en y fuera de la nave. Presencia de la mezcla de puertos permite la rápida en recipiente de mezcla y ecualización de los medios de comunicación en todas las capas de la Multi-frasco.

2. Rendimiento celular utilizando Multi-Frasco:

Estas embarcaciones están disponibles en 3 capas y formatos de 5 capas que corresponden a 3 y 5 veces la superficie de la T-175 frascos. En consecuencia, ≥ 3 y 5 veces (130 ± 6,8 x 10 ⁶ y 218 ± 23.6 x 10 ⁶ células, respectivamente), el número de células BHK-21 (riñón de hamster) las células fueron cultivadas y se recuperó de Multi-frasco en comparación con el T-175 frascos (43,2 ± 3,5 x 10 ⁶ células; Fig.2a). Celular rendimiento por uárea de superficie de nit fue equivalente en 3 - y 5-capa y multi-frascos T-175 frascos de BHK-21, LNCaP (adenocarcinoma de próstata humana línea celular), Hep-G2 (línea celular humana hepatocarcinoma), Ecopack 2-293 (humanos línea de células renales) cultivadas por un período de 48-96h (Fig.2b) en medios de cultivo (35 ml por cada capa) según lo recomendado por el fabricante de células (ATCC, Sigma y / o Clontech). Las células fueron enumerados en un sistema automatizado de Vi-contador de células ^(1).

Figura 2A: de tres y cinco veces el número de células BHK-21 se cultivaron y se recuperó de 3 - y 5-capa Multi-Frascos en comparación con el T-175 frascos. Rendimiento esperado se determinó que el rendimiento en media de células de control T-175 frascos multiplicado por tres veces y cinco para el 3 - y frascos Multi-5-capa, respectivamente (n = 4 frascos / formato).

2B> Figura: el rendimiento de la célula por cm ² fue equivalente en 3 - y 5-capa y multi-frascos T-175 frascos de BHK-21, LNCaP, y las células HepG2 EcoPack2-293. Cada barra representa la media de 4 a 6 frascos. Células BHK-21 (11.000 células/cm2) se cultivaron durante 72 horas, las células LNCaP (20.000 células/cm2) y EcoPack2-293 células (~ 35.000 células/cm2) se cultivaron durante 96 horas y las células HepG2 (25.000 células / cm ² ) se cultivaron durante 48 horas antes de la cosecha.

3. Medios de distribución entre las capas de Multi-frasco

Medio de cultivo celular (DMEM, Invitrogen) a cinco capas múltiples frascos (250 buques mL/5-layer) y se separó en capas de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Distribución de los medios de comunicación se midió mediante la perforación de agujeros en cada capa y los medios de comunicación bombea desde las capas individuales. Peso del fluido recuperado de cada capa se encontró que era relativamente uniforme de capa a capa, como se muestra en la Fig. 3. Son los siguientes: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (g).

Figura 3. Distribución de los medios de comunicación uniforme en cada una de las cinco capas de una capa de 5-Multi-Flask. Medio de cultivo celular fue introducido en varios matraces (250 buques ml/5-layer), equilibrado y dividido en capas individuales. Los medios de comunicación se bombea a través de agujeros perforados en las capas individuales y el peso de fluido se registró a partir de cada capa (n = 6 frascos).

4. Celular distribución entre las capas de Multi-frasco

Las células pueden ser añadidos y mezclados dentro del frasco de Multi-. Nos distribución simulada de las células entre las capas de Multi-frasco con gotas (10μm; Polysciences Inc.) de tamaño similar a las células. Suspensión de bolas se añadió en el recipiente Frasco de Multi-utilizando una pipeta de 10 ml a través de la capa superior y se mezcla con los medios de comunicación en el barco, como described en el protocolo anterior. Distribución de bolas se midió por los agujeros de perforación en cada capa y el líquido que contiene suspensión de bolas se bombea desde las capas individuales. Concentración de bolas recuperadas de cada capa se leyó en un contador Coulter y grabado. Se muestra a continuación son equivalentes entre capas distribuciones de grano de 3 capas múltiples frascos (Fig.4a). La mezcla de puertos permite la distribución homogénea de las células y los reactivos entre las capas Multi-Flask.

Figura 4: Distribución de bolas en cada una de las tres capas de una capa de 3 Multi-Flask. Una suspensión de cuentas (3,6 x10 ⁶ / ml) se añadió al medio se distribuye en varios matraces (suspensión de perlas: el volumen de los medios de comunicación es de 1:10, vol: vol) y se mezcla, seguido por el equilibrio y los pasos partición utilizando el protocolo descrito. Concentración de bolas recuperadas de cada capa (medio bombeado a través de agujeros perforados en cada capa) fue leído en un recuento de Coulterer y grabado. Se muestra a continuación son equivalentes entre capas distribuciones de cuentas en 3 - Multi-capa de Frascos (n = 5 frascos)

A continuación se muestran imágenes representativas de los patrones de coloración Ecopack 2-293 de las células cultivadas a la confluencia> 80% en tres capas múltiples frascos de medios de cultivo suplementados. Monocapas de células fueron fijadas y teñidas con cristal violeta y Multi-frasco capas fueron cortadas y las imágenes escaneadas ^(2). Tenga en cuenta, los patrones de células fue homogénea en todas las capas de Multi-Frasco (Fig.4B). Se obtuvieron resultados similares con múltiples tipos de células evaluados (datos no mostrados).

Figura 4B: Esta figura ilustra el crecimiento de células homogéneas entre las capas de varios frascos. Ecopack-2-293 células cultivadas a la confluencia> 80% en 3 capas múltiples frascos y T-175 fueron fijadas y teñidas con cristal violeta. Frasco de múltiples vasos fueron cortadas y cada capa manchada escaneado fue.

5 El suministro de aire en el Multi-Flask.:

El análisis de los medios de comunicación dedicado al uso de Bioprofile FLEX analizador ^(3,4) (Nova Biomedical) de EcoPack2-293 células cultivadas durante 96 horas no mostraron diferencias en la saturación del aire de las células cultivadas en varios frascos de 5 capas vs T-175 frascos (81.03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% del ambiente O _2).

Figura 5: saturación del aire (ambiente% O ₂₎ de los medios de comunicación pasaron fueron similares en los medios de comunicación pre-mezclado de varios frascos de 5 capas vs T-175 frascos. EcoPack2-293 células se sembraron a una densidad de 35.000 células / cm ² y se cultivan durante 96 horas antes a los medios de análisis (n = 3 frascos).

Discusión

El presente estudio demuestra el aumento de la productividad que el diseño del frasco de Multi-ofrece a los investigadores. Si bien es importante que siga los pasos descritos anteriormente para un rendimiento óptimo cuando se utilizan varios matraces, son pocos los pasos críticos en este protocolo que se consideran más esenciales. Estos incluyen: (i) la mezcla de las células y los reactivos a través del puerto de mezcla en el recipiente (ii) el transporte de Multi-frasco en un ángulo de 45 ° hacia la derecha después de la partición de líquido en cada una de las capas (iii) por el Multi-frasco después de la partición en el plano incubadora.

El uso adecuado de Multi-frasco lleva a la producción de una población celular homogénea dentro de cada buque que se cultiva en un ambiente que es congruente con el T-175 frascos ^(5). Estas embarcaciones ofrecen las células 3 y 5 veces más en un tamaño similar a la del frasco T-175. El recipiente 3 y 5 capas proporciona 525 y 875cm ² de área de crecimiento, respectivamente, y ofrecen el espacio y mano de obra savings a los usuarios. Cultivo de Tejidos Tratamiento de la superficie es comparable a frascos estándar lo que permite ampliación sin necesidad de volver a la optimización de las condiciones actuales la cultura o comprometer la calidad, la homogeneidad o la realización de las células ^{(6, 7).} Esto también proporciona la comparabilidad con los datos recogidos anteriormente. Estos vasos pueden ser también revestidos con reactivos tales como colágeno, fibronectina, poli-D-lisina para proporcionar un sustrato especializado para la fijación, crecimiento y diferenciación de ciertos tipos celulares como los hepatocitos ^{8, 9} kertainocytes, las células madre cultivadas en medio libre de suero formulaciones. Soluciones de revestimiento se puede quitar con una retención mínima de líquido residual con el fin de reducir el desperdicio de reactivos de gran valor, así como la eliminación eficaz de solución de revestimiento que antes el cultivo de células. El volumen recomendado del papel óptimo de las células de cultivo en varios frascos de rango 0,142 a 0,287 ml / cm ^2, que se traducen en 25 a 50 ml por cada capa. A diferencia de otro frasco de varias capas, tsu producto ofrece una combinación de puerto en el vaso que le permite rápida en recipiente de mezcla, así como una distribución uniforme de las células y los reactivos dentro y entre las capas de cada buque. Diversas líneas celulares, cultivos primarios y las células madre se han ampliado de manera eficiente el uso de varios frascos. Estos vasos sanguíneos son particularmente ventajoso en aplicaciones que requieren un gran número de células, como en el cribado de alto-, la producción de vacunas, transfecciones vector viral y terapia celular.

Ahorro de tiempo, espacio, trabajo y generación de residuos se reducen las ganancias fundamentales de la Petaca Multi-contra las culturas tradicionales en una sola capa de vasos sanguíneos. Podemos cultura aproximadamente tres veces el número de células recolectadas a partir de 5, T-175 frascos en el mismo espacio con 3, 5 capas múltiples frascos. Esta ventaja en ahorro de espacio no se limita sólo a la T-175, pero también se puede extender a otros buques: un aparato giratorio botella estándar que encaja en común incubadoras de laboratorio casas ~ 4 roller botellas (2200 ml) cada una de ellas ofrece 850cm ^{2 de} superficie. En la misma zona, aproximadamente 20, de 5 capas de varios frascos pueden ser mantenidos por lo tanto proporciona cinco veces la superficie de crecimiento de las células de cultivo. Por otra parte, con un aumento en el "Go-Green" la conciencia, las opciones para reducir la generación de residuos es altamente deseable. A este respecto, hay un 38% (5, T-175 frascos de peso ~ 640g, mientras que uno, de 5 capas Multi-frasco pesa ~ 400 g) disminución en la generación de residuos a través de múltiples cofres en comparación con el T-175 frascos y estas ventajas conducen a la disminución de almacenamiento de residuos y los costes de eliminación y el resultado en un ahorro económico para el usuario.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / Equipo	Empresa	Catálogo #	Comentarios
3-capa de Cultivo de Tejidos tratados con 525cm 2	BD Biosciences	353143	BD Biosciences cultivo celular - BD Falcon Multi-Frascos
De 5 capas de Cultivo de Tejidos tratados con 875cm 2	BD Biosciences	353144
100 ml pipeta	BD Biosciences	357600
Pipeta de 10 ml	BD Biosciences	357551
5 ml de aspiración pipeta	BD Biosciences	357501
50 ml tubo de polipropileno cónico	BD Biosciences	352070
T-175 frasco de cultivo de tejidos tratados con	BD Biosciences	353028
Gramo de cristal violeta	BD	212525
DMEM	Invitrogen	11885
GMEM	Sigma	G5154
RPMI-1640	ATCC	30-2001
MEM	ATCC	30-2003
Tripsina-EDTA	Lonza	CC-5012
El suero fetal bovino	Invitrogen	16000-044
Triptosa fosfato caldo	Sigma	T8159
Células BHK-21	Sigma	85011433
Hep-G2, LNCaP	ATCC
Ecopack 2-293	Clontech
Paraformaldehído	Microscopía electrónica de Ciencias	15710
Poliestireno bolas	Polysciences Inc.	24628-20
Bio-Flex Analizador de Perfil	Nova Biomedical