寄生在鸡模型诱导自身免疫性基因驱动恰加斯心脏疾病

摘要

接种克氏锥虫在之前孵化的受精卵呈现寄生虫kDNA minicircle胚胎细胞的基因组中的整合。杂交揭示突变的垂直转移到后代。该的kDNA集成到编码在几个染色体区域和鸡只死亡与自身免疫性炎症心脏疾病。

摘要

克氏锥虫在婴幼儿急性感染收购似乎无症状，但约三分之一的慢性感染的个案表明达三十年或稍后的南美锥虫病。自身免疫性疾病和寄生虫的持久性竞争理论来解释^1，2南美锥虫病的发病机制。南美锥虫病寄生虫的持久性和自身免疫性疾病中发挥不同的角色，我们接种的T。锥虫在气室的受精卵。成熟的鸡的免疫系统是一个严密的对T的生物屏障克氏锥虫感染根除的第一个星期增长³月底后，其免疫系统的发展。在孵化雏鸡寄生虫，但他们保留集成寄生虫线粒体动基体DNA（kDNA）minicircle在他们的基因转移到他们的后代。 kDNA在鸡基因组minicircle集成的文档由TARG获得eted总理TAIL-PCR技术，南方杂交，克隆和测序^3，4。的kDNA minicircle集成破裂转录和免疫系统因素的开放阅读框，磷酸酶（GTP酶），腺苷酸环化酶和磷酸化酶（PKC，NF-κB的激活，PI-3K）与细胞的生理，生长，分化^{3，5 - 7，}其他基因的功能。重症心肌炎，因拒绝目标心脏纤维细胞毒性T细胞效应被认为是在的kDNA突变鸡，表现出类似人类南美锥虫病看出，炎症性心肌病。值得注意的是，心脏衰竭及骨骼肌无力成年鸡目前在1号染色体⁸ kDNA dystrophin基因的断裂。类似genotipic改变与CD45的效应+，CD8γδ的，CD8α淋巴细胞进行组织破坏。因此，这种原虫感染可诱发基因驱动的自身免疫性疾病。

研究方案

1。生长寄生虫

1. T 的成长trypomastigote形式锥虫 Berenice和β-半乳糖苷酶表达的Tulahuen 吨锥虫 MHOM/CH/00的C4（L6）在小鼠肌肉细胞培养杜尔贝科最小的重要媒介与10％的FSB，100 IU / ml青霉素，100微克/毫升链霉素，和250 nm的L -谷氨酰胺（pH值7.2），5％ CO ₂在37°C。使用中上清培养基自由游泳trypomastigotes，，被接种鸡蛋。
2. 成长， 利什曼braziliensis（LB）在DMEM LTB300股票增长20％胎牛血清。在的LB promastigote形式的指数增长阶段，用于接种鸡蛋^9。

2。寄生虫接种在受精鸡蛋

1. 接种了100 吨，取消冻结锥虫 trypomastigotes在鸡蛋壳上的阶段顶部的气室，通过一个直径为2毫米的孔10μL培养基X肥沃的鸡蛋。进入胚胎细胞的致命寄生虫的侵袭和复制显示在视频S1。对照组如下:a）控制鸡;二）接收模拟控制鸡蛋10μL培养基; C）X期受精卵与暂停100 磅 promastigotes的接种在培养基中加入10μl 吨 。 锥虫和LB属于的kinetoplastid家庭。分别，这些原生动物生长在细胞质中，或在宿主细胞的虫空泡^10。
2. 用胶带封洞。
3. 孵育的T。克氏锥虫感染的鸡蛋模拟和未感染的对照样品在37.5°C和65％，湿度为21天。
4. 三个星期的小鸡，在孵化器中孵化24小时，其后保持在32°C。

3。获取样本DNA的提取

1. 鸡外周血单个核细胞获得一）孵化从T.接种锥虫鸡蛋;二）管制; C）嘲笑接收10微升培养基，D）从LB接种蛋孵化鸡白血细胞DNA的提取与处理标准协议^11。
2. 还从公鸡，母鸡孵鸡蛋与T.接种收集贫瘠的卵母细胞（<5毫米）收集精液中提取DNA 克氏锥虫 ，并从控制鸡蛋^3个，4孵出母鸡。
3. 提取的T. kDNA 锥虫 epimastigote形成，也从LB promastigotes，所述其他地方^9。

4。所用引物和探针

引物用于PCR扩增和热条件如表1所示。

在Southern印迹杂交用的探针分别为:

1. 野生，类型minicircle（〜1.4 KB）序列纯化田间从T.锥虫 epimastigote形式;
2. Minicircle片段（362 bp）的由NSI取得的我的野生型kDNA消化;
3. 核DNA（nDNA的）重复序列（188 bp）的寄生虫DNA扩增获得与Tcz1 / 2的引物。探针进行纯化，从1％琼脂糖凝胶^3。
4. 野生，类型minicircle（〜0.820 KB）序列磅 promastigotes。

5。聚合酶链反应分析

1. 基因组DNA从被感染的雏鸡和感染的控制与运行标准PCR程序和嘲笑使用吨锥虫 nDNA的Tcz1 / 2 ¹²和kDNA s35/s36的¹³引物。此外，运行磅，使用的原生动物的具体LB3和LB5引物（ 表1）感染的鸡蛋孵化鸡的基因组的DNA PCR。
2. 100 ng的模板DNA，每对引物，2个U Taq DNA聚合酶，0.2毫米的dNTP，0.4微米和1.5毫米氯化镁，使反应混合物 _{25微升的最终体积。}
3. 在68°，在72分钟的C / 1°C间前5分钟内制冷最后一次延长为5分钟，30秒30的周期在95°C/30的秒热循环程序为95℃。
4. 扩增产物在1.3％琼脂糖凝胶转移，这是由一个带正电的尼龙膜（GE生命科学）的碱性标记的特异性探针杂交方法分析_[α-32 P] dATP的使用随机引物标记试剂盒（Invitrogen公司卡尔斯巴德，加利福尼亚州）。

6。基因组Southern杂交

1. 使用MBO我和/或生态的RI（Invitrogen）的酶，使单一集成到人体组织的DNA样本minicircles削减。
2. 从感染的控制鸡和鸡的精华DNA孵化蛋从剧毒吨接种锥虫形成。
3. 主题摘要从 T的DNA 克氏锥虫和从鸡测试样品在0.8％琼脂糖凝胶电泳，在50 V过夜4°C
4. 将分离的DNA带正电的尼龙膜。
5. 无线电标记kDNA探针杂交的DNA条带。
6. 洗膜两次15分钟65°2X SSC和0.1％SDS，两次15分钟65°C间0.2X SSC和0.1％SDS，时间变量的放射自显影。

7。有针对性的总理TAIL-PCR技术

1. 获取修改后的TAIL-PCR技术的技术，它结合了kDNA特异引物引物² minicircle整合到鸡的基因组扩增的kDNA三个走在巢式PCR的周期， 如图1所示。
2. 主要周期:每个反应包括200 ng的模板DNA，MgCl _2的 2.5毫米，0.4μM的，kDNA引物（S34或S67），0.2毫米dNTPs浓度，2.5 U的Taq铂（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA）使用GG的引物（GG1 Gg6， 表1）的0.04微米kDNA引物组合，分别。设定温度从57.9到60.1°kDNA引物和从59.9至65.6℃，CR-1引物，请注意，这些温度高于（〜45°）退化的任意引物TAIL-PCR技术^10。使用温度和周期（MyCycle热循环仪，Bio-Rad公司实验室，大力士，CA）在以前的文件³所述。
3. 第二周期:从主要周期1:40（V / V）水稀释PCR产物。 kDNA引物S35和S35反义取代以往，伴随着同样的GG引物。
4. 第三周期:从二次周期1:10（V / V）水稀释PCR产物，并结合千吨引物，分别与S67反义或S36。
5. 克隆的PCR第三周期的产品:直接克隆至pGEM T easy载体（Promega公司，麦迪逊，威斯康星州）上放大产品kDNA探针杂交。
6. 选择，kDNA探头和序列杂交的克隆。
7. 从T.在300 kDNA PG混合验证tpTAIL-PCR 锥虫控制鸟类的DNA与200纳克从未暴露kDNA。用于测试鸟类DNA相同的温度和放大周期。

8。南美锥虫病的临床表现

1. 监测的增长和发展，从T.孵化鸡锥虫感染的鸡蛋来自非疫区的鸡蛋孵化和健康对照组的死亡率和疾病表现每周每天。
2. 检测这些鸡的临床异常（ 图2）和心电图（ECG）记录，以评估电轴，心脏率和心律失常^3。
3. 主题kDNA突变和控制鸡每月向增强心室联合国的心电图记录的iPolar导致aVF导联（左腿），aVL导联（左臂），AVR（右臂），并评估偏差的平均电轴左，这是提示心脏扩大^3。

9。病理和免疫组化分析

1. 自然kDNA突变鸡死亡后记录心脏和体重指数（ 图3）。获得指数也相同年龄和性别控制鸡。
2. 采取心脏，食道，肠，骨骼肌，肺，肝，肾脏的部分。
3. 修复组织中10％的福尔马林缓冲液（pH 7.4），石蜡嵌入和削减至4微米厚切片苏木素-伊红（HE）染色和病理分析（ 图3）。
4. 从胚胎的收获和对开组织接种表达β-半乳糖苷酶的寄生虫卵，孵化，X-Gal的染色。
5. 1修复的胚胎组织中的另一半0％福尔马林，pH值7.4，并继续在步骤9.3。
6. 切4μm的薄石蜡包埋组织切片，并安装在玻璃镜检查幻灯片。
7. 孵育部分显示X-Gal的蓝染细胞与人类的查加斯氏抗血清（1:1024稀释）反对抗-T。克氏锥虫抗原。
8. 与PBS，pH值7.4，5帕特里斯分钟每洗节。
9. 染色蓝色细胞在胚胎组织，通过与荧光标记的兔抗人IgG第二孵化。
10. （步骤8）用PBS洗节，安装盖玻片，观察光，紫外光照射下，蓝色细胞绿色经审查，在502 nm波长，200X放大倍率，同时位吨 ， 锥虫在胚胎细胞。

10。在心脏病变型免疫系统的细胞

1. 型免疫效应细胞在心脏组织切片从kDNA阳性和控制kDNA负鸡。
2. 将幻灯片组织切片，石蜡包埋，65°C时为30分钟，每次5分钟，融化在100％至70％的二甲苯，然后在无水乙醇PBS蜡4冲洗以前提交。
3. 幻灯片冲洗，蒸馏水，空气干燥，以及治疗特异性单克隆抗体获得从SouthernBiotech，伯明翰，AL（荧光的R-藻红蛋白标记的单克隆抗体）。
   1. 用鼠标抗鸡BU-1（BU-1 _a和BU-1 _B等位基因，先生70-75 kDa的）单克隆抗体AV20承认B细胞抗原对自交系鸡的单形性的决定因素。
   2. 用鼠标抗鸡，CD45，免疫球蛋白亚型IgM1κ特定鸡胸腺细胞系（先生190到215 kDa的变种）。
   3. 使用鼠抗鸡TCRγδ+（90-kDa的异先生）单克隆抗体的具体胸腺依赖CD8α+ T细胞。
   4. 使用鼠标抗鸡抗体CD-8鸡α链（议员34 kDa的）承认日ËCD8细胞在胸腺，脾脏，心脏和其他组织。
   5. 使用鼠标抗鸡KuL01的专门识别单核/巨噬细胞的吞噬细胞系统。
4. 洗三次幻灯片用0.1 M PBS，pH值7.4，5分钟内每一个具体的反型抗体在潮湿室90分钟后孵化。
5. 组装与缓冲考试甘油，荧光灯显微镜下用波长567和502 nm的发射滤波器的幻灯片，分别检测红色和绿色荧光标记的细胞（ 图4）。

11。数据分析

1. 使用鸡基因组数据库（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031的 BLASTN序列分析）。
2. 使用CLUSTALW路线确定E值的分数。
3. 聘请的GI国际扶轮重复屏蔽算法御史（ http://girinst.org/censor/index.php ）的不同类别的嵌合序列重复定位。
4. 聘请Kinetoplastid插入和删除序列搜索工具（吻）kDNA序列潜在gRNAs与WU-BLASTN改良基质^3的援助，以确定。
5. 使用T。锥虫序列http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas搜索，在kDNA宿主DNA嵌合体gRNAs。 11.6）使用学生的牛逼和"Kolmorov-斯米尔诺夫测试，分别为，以检测与电动轴的偏差和心脏/身体体重指数之间的显著实验组和对照组获得的差异，并以检测死亡率比孵鸡的群体之间的显著差异从T.锥虫我noculated鸡蛋和控制。

12。代表结果

接种100剧毒吨的到的锥虫 trypomastigotes不肥沃的鸡蛋气室不显着减少孵化活着的小鸡比例。约60％，孵出的健康雏鸡和40％可能发生在孵化的胚胎液化或胚胎死亡。尚存的雏鸡保留的kDNA minicircle序列基因组中的集成。但是，它预计，一些雏鸡孵化后会死在几周内与心脏和失败。其余的雏鸡将增长到外表健康的成年人。在人生的所有阶段，从他们的血液细胞中提取的DNA将产生kDNA PCR扩增，但不nDNA的。目标首相尾-PCR扩增^3，4个产品被克隆和序列将显示，kDNA minicircles主要集成在编码macrochromosomes地区1至5。显示多个kDNA我的鸡进入细胞的生长和分化，调节免疫系统的因素，和DNA修复基因编码的ntegrations是候选人进行自我靶组织（ 图3）的拒绝。例如，鸡与dystrophin基因的断裂（ 图5）显示kDNA突变，编码的蛋白质结合到细胞膜的骨架，是一个以发展自身免疫性炎症性心肌病和失败的候选人。

这些基因的修改都没有见过在磅感染的鸡蛋孵出的小鸡。 吨之间有分歧克氏锥虫和LB kDNA的minicircles;的T.穿插锥虫ķDNA minicircle平均1.4 kb的四个可变区（VR）的结构保守的区域，每个提出CSB1（CR）CSB2，和CSB3区域，其中被认为是CA丰富的弯曲的DNA复制起始的具体地点，转录，重组，横向基因转移 3。 磅，，kDNA minicircle（平均大小820 bp）的，截然不同的包含单CR自愿退休。 CR已保守CSB1（GGGCGT）和CSB2（CCCCGTTC）块，这是不同于吨锥虫 minicircles ^{15，16和17。}考虑，LB CSB3（GGGGTTGGTGTA）显示12 NTS同源的T。克氏锥虫 ，可以想象，无论是LB kDNA minicircle集成在一个多低的频率，这可能不是所使用的技术，可见，或可能，可能，而不是在鸡基因组整合。

底漆	目标DNA	序列	TM *
第34号	T.锥虫 kDNA	5'ACA的行政协调会文建会文建航管棉酚的CC 3'	57.9
第67号	T。锥虫kDNA	5'GGT的TTT GGG AGG的GG（的G / C）（G / C）（T / G）TC 3'	60.1
S 35	T.锥虫 kDNA	5'ATA ATG的交咨会GGG（的T / G）遗传算法的GAT GC 3'	59.4
S 36	T.锥虫 kDNA	5'GGT的TCG的ATT GGG滋养细胞GGT的G 1"	57,9
LB3	磅 kDNA	5'GGG GGT的糖耐量多伦多的ATA豪TGG G 1"	55.9
LB5	磅 kDNA	5'CTA ATT GTG CAC GGG GAG的G 1"	61.4
GG 1	鸡内金	5'AGC TGA台泥的TAA AGG的造影AGC 3'	60.1
GG2	G.的鸡	5'CTG的AGC的反恐TGCTTT棉酚3'	56.8
gg3	G.的鸡	5'TTT民航局AGC AGA GGC TCG的G 1"	60.1
gg4	G.的鸡	3，GCT公司CTG的建TTA GGA TCA的GCT的5'	64.2
gg5	G.的鸡	3'AGC的AAC TCA的图文影像集团台泥行政协调会测控5'	62.3
gg6	G.的鸡	3'CTG的TTA GCA的热重GGC TTC ACA的5'	60.4

表1。素数用于PCR扩增。 * TM =平均退火温度°C。

图1。TP TAIL-PCR技术战略用来检测到鸡内金基因组克氏锥虫 kDNA整合。 A）与kDNA片段嵌合序列保守（深蓝色）和可变minicircle（淡蓝色）在4号染色体的¹⁰鸡的基因组（绿色）（AY237306）在轨迹NW_001471687.1集成的区域被用来获取主机特异引物集（GG1 Gg6）。乙）的TP TAIL-PCR技术扩增发起的minicircle特定的S34或S67引物组合鸡具体的GG1到Gg6引物退火（主循环）。稀释后的产品提供二级周期的S35（正义/反义）引物和GG 的引物组合的模板。在第三周期，二级品稀释遭到kDNA S36或S67反义引物扩增与GG 的引物组合第c）这些扩增产物进行分离，在1％琼脂糖凝胶转移到尼龙膜上，与具体的kDNA探针杂交。样品呈现出积极的信号被用于克隆确定的结合点。凝胶上显示的组合kDNA GG1到Gg6针对性。连续PCR反应扩增kDNA minicircles（蓝色）和禽流序列（绿色）的目标kDNA宿主的DNA序列。 ^（3 公共科学图书馆被忽视的热带病重印）。

图2。基因线粒体kDNA的集成修改了9个月大的鸡的心脏功能受损的临床表现minicircle从T.锥虫 。血氧差的线粒体kDNA突变紫色的梳子对比显示与控制9个月大的chicke明亮的红色的鸡冠鸡列印无心脏损害。 ^（3 公共科学图书馆被忽视的热带病的修改）。

图3。总值和微观病理kDNA突变与棒棒鸡 。一）心脏在9个月的老母鸡，心脏衰竭死亡。 b）从一个未感染的9个月的老母鸡控制心脏。 ）目标的心脏细胞的细胞毒性T细胞的抑制:描绘与最小抑制免疫淋巴细胞对靶细胞裂解酶单位（圆圈）。 D）控制心脏组织学^（3 公共科学图书馆被忽视的热带病的修改）。

图4。浸润心脏如图3所示的kDNA突变鸡的免疫系统细胞的免疫细胞化学分析。一）CD45的+淋巴细胞在心脏LE（箭头）sions由1藻红蛋白标记的特异性单克隆抗体。二）CD8 + +γδ免疫的淋巴细胞（箭头）参与在心脏的严重破坏。三）丰富的CD8α+ T细胞中存在严重的病变心脏细胞裂解酶。插入显示在控制感染的鸡的心^（3 公共科学图书馆被忽视的热带病的修改）的情况下对免疫系统的细胞。

图5。恰加斯样扩张炎症性心肌病在kDNA在dystrophin基因的整合的F2代后代。一）扩张型心肌病心脏占据大部分的胸腔（心脏重量=16克），在10个月大的鸡。 b）暗轮单核细胞浸润和破坏心肌kDNA突变的母鸡。 c）10个月大的控制鸡的正常心脏的大小（重量7克）。四）控制鸡心脏的正常组织学。 （从公共科学图书馆被忽视的热带修改人疾病^3）。

图6。比较kDNA变异鸡和人类南美锥虫病的病理。 a）严重心肌炎和目标的心脏细胞裂解酶在鸡kDNA突变。 b）严重心肌炎和靶细胞裂解酶的的恰加斯心脏疾病的情况下，免疫淋巴细胞。三）拒绝心脏细胞在kDNA突变的鸡的免疫淋巴细胞。 d）抑制心脏细胞在人类南美锥虫病的免疫淋巴细胞。 Hematoxilin和曙红染色。 （来自Memórias的修改做研究所奥斯瓦尔多·克鲁斯 ，里约热内卢^14）。

讨论

相反到哺乳动物容易受到终身吨克氏锥虫感染，鸡难治吨克氏锥虫感染。鸡模型系统的主要优点是消除感染的早期胚胎的免疫系统的发展。因此，唯一的寄生虫在鸡体内剩余的DNA被整合在几个位点。

使用剧毒吨的最优数量锥虫 trypomastigotes接种受精卵是向鸡胚胎的基因组整合kDNA minicircles获得关键的一步。现场的小鸡从100 trypomastigotes接种的鸡蛋孵化的速度是比获得500寄生虫的高4倍。应小心在10μL培养基接种到鸡蛋的气室中的寄生虫暂停。应该是没有蛋清泄漏。在最佳条件下，细胞内的寄生虫感染发生无线此后的感染是由先天免疫淘汰;几个小时后，一个星期内的宿主细胞所得的孵化和寄生虫乘法薄。 kDNA整合需要一个生活的感染，并不会导致融合成早期胚胎鸡蛋裸minicircles接种。在受控条件下的的kDNA阳性胚胎和控制应该被安置在37.5°C和65％的湿度。雏鸡在33℃室温存放在两个星期的笼子。此后，鸡在笼子里的暂停架1.5米宽的过道隔开的房间在22°C间过滤空气和积极的压力，以确保动物福利条件下不断枯竭。成人喂养的鸡议员，喝饮用水的自来水，实现全面成长和成熟，铺设鸡蛋在5个月的年龄。卫生程序维护结果的重复性的基本以 T工作时锥虫接种成肥沃的鸡蛋。

在鸡模型系统的T.克氏锥虫感染根除后，免疫系统的发育在胚胎发育的初期。此外被感染，从T.孵化小鸡锥虫接种的鸡蛋，在缺乏特异性抗体，是宽容的寄生虫抗原。 kDNA突变基因型修改和免疫监视击穿³鸡只被视为拒绝目标的心脏细胞的细胞毒性T细胞（最小单位拒绝， 图3）。基因型修改的T细胞呈现在体内自我组织加速排斥反应。主要病变部位是心脏，这是南美锥虫病的一个标志。从生理（监察）通过一个病理生理状态，显示克隆³细胞毒性T细胞增殖的在kDNA突变的鸡。

ţ他transkingdom模型系统显示了一种寄生虫引起的，基因驱动的自身免疫性疾病（ 图6），从基因组的修改所产生的T。锥虫 kDNA minicircle集成。这些修改都没有见过从磅接种的鸡蛋孵出小鸡。

这种现象表明，炎症在kDNA突变鸡的自身免疫性心肌病的实验性治疗，可能需要药物抑制骨髓祖细胞浸润心肌特异性T细胞型，histocompatible健康的骨髓移植，以防止排斥反应的自我组织。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
的Taq DNA聚合酶重组	Invitrogen公司	11615-010
铂金的Taq DNA聚合酶	Invitrogen公司	10966-030
随机引物DNA标记系统	Invitrogen公司	18187-013
生态国际扶轮	Invitrogen公司	15202-021
MBO我	Invitrogen公司	15248-016
核苷酸集，100mm的解决方案	GE医疗	28-4065-51
Amersham公司Hybond - N + -猫列印。	GE医疗集团	RPN303B
PlasmidPrep迷你自旋套件	GE医疗集团	28-9042-70
NSI我	Sigma-Aldrich公司	R5884每千
DNA，钠盐鱼精子	AMRESCO	0644-10G
鼠抗鸡卜-1B	SouthernBiotech	8370-02
鼠抗CD45的鸡	SouthernBiotech	8270-08
鼠抗鸡TCRγδ	SouthernBiotech	8230-08
鼠抗鸡CD8α	SouthernBiotech	9220-02
鼠抗鸡单核细胞/巨噬细胞	SouthernBiotech	8420-02
MyCycle Termocycler	BIO-RAD实验室	580BR 5501