Паразита индуцированные генетически Руководствуясь аутоиммунные болезни Шагаса сердца в куриный модели

Резюме

Прививки Trypanosoma cruzi В оплодотворенные яйца до инкубации оказывает паразит kDNA minicircle интеграции в геном клеток зародыша. Скрещивание показывает вертикальную передачу мутаций в потомстве. KDNA интегрируется в области кодирования на нескольких хромосом и куры умирают с воспалительным аутоиммунным заболеванием сердца.

Аннотация

Trypanosoma cruzi острых инфекций, приобретенных в младенчестве и детстве, кажется бессимптомно, но примерно треть хронически инфицированных случаи показывают, болезнь Шагаса до трех лет или позже. Аутоиммунные и паразитов настойчивость конкурирующих теорий для объяснения патогенеза болезни Шагаса ^{1, 2.} Для отдельных ролей паразита настойчивость и аутоиммунных в болезнь Шагаса мы привить T. cruzi в воздухе камеры оплодотворенных яиц. Зрелые курица иммунная система жесткой биологический барьер против Т. cruzi и искоренить инфекции на развитие его иммунной системы к концу первой недели роста ^3. Птенцы паразитов по бесплатному штриховки, но они сохраняют интегрированы паразита митохондриальной ДНК kinetoplast (kDNA) minicircle в их геноме, которые передаются потомству. Документация kDNA minicircle интеграции в геном курицы было получено Таргeted премьер-ХВОСТ-PCR, Южной гибридизации, клонирования, секвенирования и ^{3, 4.} KDNA minicircle интеграции разрыв открытых рамок считывания для транскрипции и иммунные факторы системы, фосфатазы (ГТФ), аденилатциклазы и фосфорилазы (ПКС, NF-каппа В активатор, PI-3K), связанные с клеточной физиологии, роста и дифференциации ^{3, 5 - 7,} и другие функции гена. Тяжелый миокардит в связи с отказом от волокон целевой сердце эффекторов цитотоксических лимфоцитов проявляется в kDNA мутировал кур, показывая воспалительный кардиомиопатия аналогичным тому, которое наблюдалось в человеческой болезни Шагаса. В частности, сердечной недостаточности и слабости скелетных мышц присутствует у взрослых кур kDNA разрыва в гене дистрофина в хромосоме 1 ^8. Подобные genotipic изменения, связанные с разрушением тканей осуществляется эффекторов CD45 +, CD8γδ +, CD8α лимфоцитов. Таким образом, этот простейший инфекция может вызвать генетически управляемых аутоиммунных заболеваний.

протокол

1. Рост паразитов

1. Рост trypomastigote форм Т. cruzi Береника и β-галактозидазы, выразив Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 в мышиные клетки мышцы (L6) выращивают в Дульбекко минимальный основной среде с 10% FSB, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 250 нМ L-глутамин (рН 7,2), 5% CO ₂ при 37 ° C. Свободное плавание trypomastigotes в надосадочной среды были использованы для заражения куриных яиц.
2. Рост Leishmania braziliensis (Lb) LTB300 акции выросли в DMEM с 20% ЭТС. Форма Lb промастиготы в экспоненциальной фазе роста использовали для инокуляции яиц ^9.

2. Прививка паразитов в оплодотворенных куриных яиц

1. Инокулировать подвески 100 т. cruzi trypomastigotes в 10 мкл культуральной среды через 2-мм отверстие в оболочке яйца на верхней воздушной камеры стадииX оплодотворенные яйца. Вторжения и репликации опасных паразитов в клетках эмбриона показано в видео S1. Контрольной группы являются следующие: а) контроль кур, б) макет яйца контроль получения 10 мкл культуральной среде, в) этап X оплодотворенные яйца привитых с подвеской 100 promastigotes Lb в 10 мкл культуральной среды Т.. cruzi и Lb принадлежат kinetoplastid семьи. Соответственно, эти простейшие расти свободно в цитоплазме или в паразитофорной вакуоли клеток хозяина ^10.
2. Уплотнение отверстия липкой лентой.
3. Инкубируйте T. cruzi-инфицированные яйца и макет и неинфицированных контрольных проб в 37,5 ° C и 65% влажности в течение 21 дней.
4. Держите цыплят, которые вылупляются в инкубаторе в течение 24 ч, а затем при 32 ° C в течение трех недель.

3. Получение образцов для выделения ДНК

1. Мононуклеаров периферической крови клетки были получены от кур: а)вылупившиеся из T. cruzi привиты яйца, б) контроля, в) получение издевается 10 мкл культуральной среды, г) вылупился из яйца Lb привиты, белые кровяные клетки с курами, обрабатываются для экстракции ДНК в соответствии со стандартным протоколом ^11.
2. Извлечение ДНК из спермы также собраны из петухов, и от бесплодных ооцитов (<5 мм), собранных от кур, вылупившихся из яиц привитых с Т. cruzi, и кур, вылупившихся из яиц контроль ^{3, 4.}
3. Извлечение kDNA от Т. cruzi эпимастигота формы и, кроме того, из Lb promastigotes, как описано в другом месте ^9.

4. Праймеры и зонды использовано

Праймеров для амплификации ПЦР и тепловые условия приведены в таблице 1.

Зонды, используемые в Южной гибридизации пятном были:

1. Дикого типа minicircle (~ 1,4 кб) последовательностей пуриFied от Т. cruzi эпимастигота форм;
2. Minicircle фрагментов (362 б.п.), полученный НСИ я дайджесты дикого kDNA;
3. Ядерная ДНК (nDNA) повторяющиеся последовательности (188 б.п.), полученный усиления паразита ДНК с Tcz1 / 2 праймеров. Зонды были очищены от 1% агарозном геле ^3.
4. Дикого типа minicircle (~ 0,820 кб) последовательностей из Lb promastigotes.

5. ПЦР-анализ

1. Выполните стандартную процедуру ПЦР с геномной ДНК от инфицированных цыплят и неинфицированных управления и издеваться над использованием T. cruzi nDNA Tcz1 / 2 ¹² и kDNA s35/s36 ¹³ праймеров. Кроме того, работать ПЦР с геномной ДНК от кур вылупившихся из Lb-инфицированные яйца помощью простейших конкретных Lb3 и Lb5 праймеров (табл. 1).
2. Сделать реакционной смеси с 100 нг ДНК-матрицы, 0,4 мкМ каждой пары праймеров, 2 U Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мМ дНТФ и 1,5 мМ MgCl 2 в 25 мкл конечного объема.
3. Установите программу для Термоциклер 95 ° C в течение 5 мин, 30 циклов 30 секунд при 95 ° C/30 сек при 68 ° С / 1 мин при 72 ° С, 5 мин окончательное расширение до охлаждения.
4. Анализ продуктов амплификации в 1,3% агарозном геле, который передается на положительно заряженных нейлоновую мембрану (GE Life Sciences) в щелочной метод гибридизации с зондами помечены _[α-32 P] дАТФ использованием случайного праймера маркировки Kit (Invitrogen , Карлсбад, Калифорния).

6. Геномная Южной Блоты

1. Используйте Мбо я и / или Eco RI (Invitrogen) ферменты, которые делают одно сокращение minicircles интегрирована в ДНК образцов тканей тела.
2. Дайджест ДНК из неинфицированных кур контроля, а также куры вылупился из яйца привитых с опасной T. cruzi формы.
3. Тема дайджесты ДНК T. cruzi ииз образцов куриного тест для электрофореза в 0,8% агарозном геле при 50 В течение ночи при 4 ° C.
4. Передача разделенных групп ДНК положительно заряженными нейлоновую мембрану.
5. Гибридизации ДНК полосы с надписью радио kDNA зонда.
6. Вымойте мембраны дважды в течение 15 мин при 65 ° C с 2X SSC и 0,1% SDS, дважды в течение 15 мин при 65 ° С каждой 0,2 x SSC и 0,1% SDS и авторадиограмма для различных периодов времени.

7. Целевые премьер-ХВОСТ-PCR

1. Получить усиления kDNA minicircle интегрироваться в геном куриного модифицированным Хвост-PCR метод, который сочетает в себе kDNA грунтовки с конкретными грунтовка устанавливает ² в трех ходить в циклах ПЦР, как показано на рисунке 1.
2. Первичный цикл: каждая реакция включает в себя 200 нг ДНК-матрицы, 2,5 мМ MgCl ₂ и 0,4 мкМ kDNA праймеров (S34 или S67), 0,2 дНТФ мм, 2,5 U Taq Platinum (Invitrogen, Карловы Вары, CА). Используйте kDNA грунтовки в сочетании с 0,04 мкМ гг праймеров (gg1 в Gg6, таблица 1), отдельно. Установите температуру с 57,9 до 60,1 ° С в течение kDNA грунтовки и с 59,9 до 65,6 ° C для CR-1 грунтовки. Обратите внимание, что эти температуры выше, чем у (~ 45 ° C), необходимых для произвольного вырожденного праймеры, используемые в хвост-PCR ^10. Использование температуры и циклы (MyCycle Термоциклер, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), описанной в предыдущей статье ^3.
3. Вторичный цикл: Развести продуктов ПЦР с основной цикл 1:40 (об / об) в воде. kDNA грунтовки S35 и S35 антисмысловых заменили предыдущие, вместе с теми же праймерами гг.
4. Третичного цикла: развести PCR продуктов из вторичного цикла 1:10 (объем / объем) в воде и объединить гг грунтовки с S67 или S36 антисмысловых отдельно.
5. Клонирование ПЦР третичного цикла продукции: Clone непосредственно в pGEM T легко вектор (Promega, Madison, WI)продукции, что последнее усиление гибридизации с kDNA зонда.
6. Выберите клонов путем гибридизации с зондом kDNA и последовательности.
7. Проверка tpTAIL-ПЦР в смеси 300 мкг kDNA от Т. cruzi с 200 нг ДНК от контроля птиц никогда не подвергается kDNA. Температуры и усиление циклов такие же используются для ДНК-теста птиц.

8. Болезнь Шагаса клинических проявлений

1. Мониторинг роста и развития цыплят вылупились из T. cruzi инфицированные яйца и здоровых вылупившихся из незараженных яиц в день смертность и еженедельно для проявлений болезни.
2. Обнаружение клинических отклонений в этих кур (рис. 2) и сделать электрокардиограф (ЭКГ) записи для оценки электрической оси, ЧСС и аритмии ^3.
3. Тема kDNA-мутировал и контролирует кур ежемесячно ЭКГ расширенной желудочка ООНipolar приводит AVF (левая нога), AVL (левая рука) и AVR (правая рука), и оценить отклонение средней электрической оси влево, что наводит на мысль о расширении сердца ^3.

9. Патология и иммунохимических анализов

1. Сердце записи и индексы массы тела после смерти природных kDNA мутировал кур (рис. 3). Получить индексы также для управления кур одного и того же возраста и пола.
2. Возьмите разделы из сердца, пищевода, кишечника, скелетных мышцах, легких, печени и почек.
3. Исправить ткани в буферном 10% формалина (рН 7,4), вставлять в парафин и сократить до 4 мкм разделы гематоксилин-эозином (HE) окрашивания и гистологического анализа (рис. 3).
4. Урожай и делить пополам тканей эмбрионов вылупился из яйца паразитов, привиты с выражением β-галактозидазы, и в соответствии с X-Гал-пятно ^9.
5. Закрепите вторую половину ткани эмбриона в 10% формалине, рН 7,4 и действовать, как в шаге 9.3.
6. Вырезать 4μm тонкий парафин ткани раздел и установить на стекло для микроскопического исследования.
7. Инкубируйте разделы, отображающая X-Gal окрашенных синей клетки человека chagasic антисыворотки (1:1024 разбавления) против анти-Т cruzi антигена.
8. Вымойте разделы мигом с PBS, 7,4 рН, 5 мин.
9. Пятно синий клеток в эмбрион тканей второй инкубации с флуоресцеин-сопряженных кроличьих анти-IgG человека.
10. Вымойте участки с PBS (шаг 8), крепление с покровным и наблюдать синий свет клетки-зеленым на рассмотрение в УФ-свете при 502 нм, 200х увеличение, для colocalizing T. cruzi в зачаточном состоянии клеток.

10. Фенотип клетки иммунной системы, в сердце поражения

1. Фенотип клетки иммунной системы эффекторов в срезах ткани сердца от kDNA-положительных и от контроля kDNA-отрицательные кур.
2. Поместите слайды ссрез ткани в парафин при температуре 65 ° С в течение 30 мин, чтобы расплавить воск до представления в четырех моет в 100% до 70% ксилола, а затем в абсолютном этаноле PBS в течение 5 минут каждый.
3. Промойте слайдов в дистиллированную воду, воздух сухой, и обращаться с конкретными моноклональных антител (флуоресцеин или R-фикоэритрин конъюгированных моноклональных антител), полученные из SouthernBiotech, Бирмингем, Алабама.
   1. Используйте мышь, анти-курица-Бу-1 (Bu-1 и Ви-1 аллелей _б, г-н 70-75 кДа) Маб AV20 признать мономорфных детерминант на антигенов клетки инбредных кур.
   2. Используйте мышь, анти-CD45 курица, Ig изотипа IgM1 κ относящиеся к куриным тимуса линии клеток (г-н от 190 до 215 кДа вариант).
   3. Используйте мышь, анти-курица TCRγδ + (Г-н 90-кДа гетеродимер) Маб, специфичные для тимус зависимых CD8α + Т-клеток.
   4. Используйте мышь, анти-курица Маб CD-8, специфичные для куриных α цепь (г-н 34 кДа) признать йэлектронной CD8 клеток в тимоцитов, селезенки, сердца и других тканей.
   5. Используйте мышь, анти-курица KuL01 исключительно признать, моноциты / макрофаги фагоцитарной системы.
4. Вымойте слайд три раза с 0,1 М PBS, рН 7,4, 5 мин после инкубации с конкретными анти-фенотип антител в течение 90 мин во влажной камере.
5. Соберите слайд с буфером глицерин для экзамена по флуоресцентным микроскопом с испусканием фильтр с длиной волны 567 и 502 нм, соответственно, для обнаружения красного и зеленого флуоресцентного меченых клеток (рис. 4).

11. Анализ данных

1. Использование базы данных куриного генома ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) для анализа BLASTN последовательности.
2. Используйте CLUSTALW выравнивания для определения электронной значения баллов.
3. Применять Г.И.RI повторить алгоритм маскировки цензура ( http://girinst.org/censor/index.php ) для локализации различных классов повторяется в химерных последовательностей.
4. Применять Kinetoplastid вставки и удаления последовательности Search Tool (KISS) для выявления потенциальных gRNAs в последовательности kDNA, с помощью WU-BLASTN модифицированных-матрицей ^3.
5. Использование Т. cruzi последовательности http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas искать в gRNAs в kDNA хозяина химеры ДНК. 11.6) Использование Стьюдента и Kolmorov-Смирнова испытания, соответственно, для выявления существенных различий между отклонений электрической оси, а также между сердцем / тело показатели веса, полученные в экспериментальной и контрольной групп, а также для выявления смертности соотношения значимых различий между группами цыплят вылупились от Т. cruzi яnoculated яйца и от контроля.

12. Представитель Результаты

Прививка 100 опасных Т. cruzi trypomastigotes в воздухе камеры оплодотворенные яйца куриные не значительно сократить отношения цыплят живьем. Около 60% здоровых цыплят люк и 40% могут подвергаться сжижению эмбриона или зародыша смерти вылупления. Оставшиеся в живых цыплят сохранить последовательность kDNA minicircle интегрироваться в геном. Тем не менее, ожидается, что некоторые птенцы погибнут с кардиомегалия и неудачи в течение нескольких недель после вылупления. Остальные цыплят возрастет до внешне здоровых взрослых людей. На всех этапах жизни ДНК, выделенной из крови мононуклеаров даст ПЦР-амплификации kDNA, но не nDNA. Целевых премьер-ХВОСТ-PCR ^{3, 4} продуктов, которые клонируются и последовательность покажет kDNA minicircles интегрированы в основном в регионах кодирования macrochromosomes 1 до 5. Куры отображения нескольких kDNA яntegrations в генах, кодирующих роста и дифференцировки клеток, иммунных факторов системы регуляции и репарации ДНК являются кандидатами для прохождения отказ от самостоятельного тканях (рис. 3). Например, курица показывает kDNA мутации с разрывом в гене дистрофина (рис. 5), кодирующих белок, который связывает цитоскелета к клеточной мембране, является кандидатом на развитие аутоиммунных воспалительных кардиомиопатии и неудачи.

Эти модификации генома не видел цыплят из Lb инфицированных яиц. Существуют различия между T. cruzi и Lb kDNA minicircles, Т. cruzi к ДНК minicircle среднем 1,4 кб структуру с четырьмя переменными области (VR) перемежаются консервативных регионов (CR), каждый представляет CSB1, CSB2 и CSB3 регионов, в которых CA-богатые ДНК изогнутые рассматриваются конкретные сайты для инициации репликации, транскрипции, рекомбинации, так и для горизонтальной передачи ДНК 4. Контрастно, Lb kDNA minicircle (средний размер 820 б.п.) содержит одну CR следует VR. CR сохранил CSB1 (GGGCGT) и CSB2 (CCCCGTTC) блоки, которые отличаются от тех, в Т. cruzi minicircles ^{15, 16 и 17.} Учитывая, что Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) показывает 12 НТС гомологии T. cruzi можно предположить, что либо Lb kDNA minicircle интегрируется в более низких частот, которые могут быть не видны на методы, используемые, или что он может, вероятно, не интегрируются в геном курицы вообще.

Грунтовка	ДНК-мишени	Последовательность	Т *
S 34	Т. cruzi kDNA	5 'ACA ОСО ACC ОСО УВД ГАА CC 3'	57,9
S 67	Т.cruzi kDNA	5 'ГГТ ТТТ GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3 "	60,1
S 35	Т. cruzi kDNA	5 'ATA ATG TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3'	59,4
S 36	Т. cruzi kDNA	5 'ГГТ TCG АТТ ГТТ ГГТ GGG G 3 "	57,9
Lb3	Lb kDNA	5 'GGG GTT ГГТ GTA ATA TAG TGG G 3 "	55,9
Lb5	Lb kDNA	5 'CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3 "	61,4
GG 1	Gallus Gallus	5 'AGC TGA TCC ТАА CAG AGG AGC 3'	60,1
GG2	Г. Gallus	5 'КТГ AGC СТС ТГКТТТ ГАА 3 '	56,8
Gg3	Г. Gallus	5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3 "	60,1
GG4	Г. Gallus	3 'GCT КТГ CCT TTA GGA TCA GCT 5'	64,2
Gg5	Г. Gallus	3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5'	62,3
Gg6	Г. Gallus	3 'КТГ TTA GCA TGA GGC TTC ACA 5'	60,4

Таблица 1. Простые, используемые в ПЦР уточнениями. * Т = средняя температура отжига ° C.

Рисунок 1. Р Хвост-PCR стратегия используется для обнаружения Trypanosoma cruzi kDNA интеграции в Gallus Gallus генома. А) химерных последовательностей с фрагментом kDNA minicircle консервативных (синий) и переменной (голубой) регионов интегрирована в очаге NW_001471687.1 в хромосоме 4 (AY237306) из куриного генома ¹⁰ (зеленый) был использован для получения принимающей конкретного набора праймеров (gg1 в Gg6). Б) р Хвост-PCR амплификации были начаты (первичный цикл) по отжигу minicircle конкретных S34 или S67 грунтовки в сочетании с куриным конкретных gg1 в Gg6 праймеров. Разводненная продуктов, предоставляемых шаблон для вторичного цикла с S35 (смысл / антисмысловые) грунтовки и комбинации праймеров гг. В третичном цикле разведения вторичные продукты подвергали амплификации kDNA S36 или S67 грунтовки антисмысловых в сочетании с грунтовкой Ггс. C) Эти продукты амплификации разделяли в 1% агарозном геле и переданы в нейлоновой оболочкой, гибридизации с зондом конкретных kDNA. Образцы показывает позитивный сигнал были использованы для клонирования, чтобы определить точку интеграции. Комбинации kDNA и целевых gg1 в Gg6 показаны в верхней части геля. Последовательных реакций ПЦР усиления целевой kDNA хозяина ДНК с kDNA minicircles (синий) и птичий последовательность (зеленый). (Перепечатано из PLoS забытых тропических болезней ^3).

Рисунок 2. Клинические проявления нарушения функции сердца в 9-месячный цыпленок генетически модифицированные интеграции митохондриальной kDNA minicircle от Т. cruzi. Бедная кислородом кровь митохондриальной kDNA мутировал курица показывает фиолетовый контрастов гребень с ярко-красными гребень управление 9-месячного chickeя свободна от повреждения сердца. (По материалам PLoS забытых тропических болезней ^3).

Рисунок 3. Гросса и микроскопических патологии Gallus Gallus с мутациями kDNA. А) Кардиомегалия в 9-месячный курицу, которая умерла от сердечной недостаточности. Б) Управление сердце от неинфицированных 9-месячного курицы. C) Отказ от клетки-мишени сердца цитотоксических лимфоцитов: минимальная единица отказ с лизиса клеток-мишеней иммунной лимфоцитов изображен (круг). D) Управление сердце гистологии (с изменениями по PLoS забытых тропических болезней ^3).

Рисунок 4. Иммуноцитохимическая анализ клетки иммунной системы проникают в сердце kDNA-мутировал курица показано на рисунке 3. А) CD45 + лимфоцитов определены (стрелки) в сердце леsions по фикоэритрин-меченных моноклональных антител. B) CD8 + γδ иммунных лимфоцитов (стрелки), участвующих в серьезные разрушения сердца. С), обильные CD8α + Т-клеток, присутствующих в тяжелые поражения сердца с лизирует клетки. Вставки показывают отсутствие клеток иммунной системы в борьбе неинфицированных сердце курицы (с изменениями по PLoS забытых тропических болезней ^3).

Рисунок 5. Шагаса, как расширенные воспалительных кардиомиопатии в F2 потомство с kDNA интеграции в гене дистрофина. А) Расширенные сердце в 10-месячный цыпленок занимает большую часть грудной полости (сердце вес = 16 г). Б) темный круглый мононуклеарных инфильтратов и разрушает клетки миокарда kDNA-мутировал курицы. C) Нормальный размер сердца (весом 7 г) на 10-месячный контроль курицы. D) Нормальный гистологии сердца куриного управления. (По материалам PLoS забытых Tropicдр. болезней ^3).

Рисунок 6. Сравнительная патология в kDNA-мутировал курицу и в человеческой болезни Шагаса. А) тяжелый миокардит и целевых лизирует клетки сердца в kDNA-мутировал курицы. Б) Тяжелый миокардит и лизиса клетки-мишени иммунной лимфоцитов в случае сердечно-сосудистых заболеваний Шагаса. C) Отказ от сердечных клеток иммунной лимфоцитов в kDNA-мутировал курицы. D) Отказ от сердечных клеток иммунной лимфоцитов человека болезнью Шагаса. Окраска по гематоксилином и эозином. (С изменениями по Memorias сделать Института Освальдо Круса, Рио-де-Жанейро, ^14).

Обсуждение

В отличие от млекопитающих, восприимчивых к пожизненной T. cruzi инфекций, куры с предубеждением относятся к Т. cruzi инфекции. Основное преимущество модели системы курица является устранение инфекции на ранних стадиях разработки эмбрионального иммунной системы. Таким образом, только ДНК паразита оставаясь в куриных тела интегрировано в нескольких локусов.

Использование оптимального количества вирулентных T. cruzi trypomastigotes привить плодородной яйцо является критическим шагом на пути к получению интеграции kDNA minicircles в геном эмбриона цыпленка. Скорость вылупления птенцов живого из яйца привиты 100 trypomastigotes в четыре раза выше, чем полученная с 500 паразитов. Следует проявлять осторожность, чтобы привить паразитов суспензии в 10 мкл культуральной среды в камеру воздух яйцо. Там не должно быть утечки яичный белок. При оптимальных условиях внутриклеточной паразитарной инфекции происходит штонкие через несколько часов после инкубации и размножения паразитов внутри клетки-хозяина доходов в течение одной недели, после чего инфекция устранить врожденный иммунитет. Интеграция kDNA требует живой инфекции и прививки голый minicircles в раннем яйца куриного эмбриона не приводит к интеграции. KDNA-положительных эмбрионов и контроля должны быть размещены в контролируемых условиях на 37,5 ° C и 65% влажности. Птенцы находятся в клетках в течение двух недель при 33 ° C комнатной температуры. После этого куры содержатся в клетках на стеллажах приостановлено разделенных на 1,5 м в ширину прохода в помещении при температуре 22 ° C с фильтром воздуха и избыточного давления при постоянном истощении обеспечить условия животных. Взрослые кормят куриным-чау и пить питьевой водой для достижения полного роста и зрелости, откладывают яйца в пять месяцев. Обеспечение гигиенических процедур необходимы для воспроизводимости результатов при работе с Т. cruzi привитыв оплодотворенные яйца куриные.

В системе куриных модель Т. cruzi инфекции уничтожаются после того, как развитие иммунной системы в раннем периоде роста зародышей. Кроме того, чтобы быть свободным инфекции, цыплят, которые вылупляются из T. cruzi привиты яйца, в отсутствие специфических антител, которые устойчивы к паразиту антигенов. Отказ от целевых клеток сердца цитотоксическими лимфоцитами (минимальная единица отказ, на рисунке 3) рассматривается в kDNA-мутировал кур показывающие изменения генотипа и разрушение иммунологический надзор ^3. Генотипически измененных Т-клетки представляют ускоренный отказ от самостоятельного ткани в организме. Основной сайт поражение сердца, которое является отличительной чертой болезни Шагаса. Переход от физиологических (надзора) в physiopathologic состояние проявляется в kDNA-мутировал курица показывает клонально распространения цитотоксических лимфоцитов ^3.

Тего transkingdom модель системы показывает, вызванные паразитами, генетически управляемых аутоиммунные заболевания (рис. 6), вытекающие из модификаций генома T. cruzi kDNA minicircle интеграции. Эти изменения не видны в птенцы вылупились из LB-привиты яйца.

Это явление позволяет предположить, что экспериментальное лечение воспалительных аутоиммунных кардиомиопатии в kDNA-мутировал кур может потребоваться препарат подавления костного мозга предшественников специфических Т-клеточный фенотип проникают в миокарде, и трансплантация histocompatible здоровый костный мозг, чтобы предотвратить отказ от самостоятельного ткани.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Taq ДНК-полимераза рекомбинантных	Invitrogen	11615-010
Платиновый Taq ДНК-полимераза	Invitrogen	10966-030
Случайные ДНК праймеры системы маркировки	Invitrogen	18187-013
Eco RI	Invitrogen	15202-021
Я Мбо	Invitrogen	15248-016
дНТФ Set, 100 решений	GE Healthcare	28-4065-51
Amersham Hybond - N + - Кошка н.	GE Healthcare	RPN303B
PlasmidPrep Мини Спин комплект	GE Healthcare	28-9042-70
Я НСИ	Sigma-Aldrich	R5884 1KU
ДНК, натриевая соль рыбы спермы	AMRESCO	0644-10G
Мышь против куриной Бу-1b	SouthernBiotech	8370-02
Мышь анти-CD45 курица	SouthernBiotech	8270-08
Мышь против куриной TCRγδ	SouthernBiotech	8230-08
Мышь против куриной CD8α	SouthernBiotech	9220-02
Мышь против куриной моноцитов / макрофагов	SouthernBiotech	8420-02
MyCycle Termocycler	Bio-Rad Laboratories	580BR 5501