单细胞基因转录的RNA荧光分析<em在原位</em&gt;杂交（FISH）

摘要

荧杂交（FISH），以确定在单个细胞中的mRNA转录如同时转录中的一个以上的成员的允许多基因活性分析 VAR多基因家族恶性疟原虫受感染的红细胞 ¹。该技术的适应性和可用于不同类型的基因，细胞和有机体。

摘要

恶性疟原虫感染的红细胞（IE）在疟疾感染的人脐静脉内皮受体介导的黏附表达的PfEMP1 由 var基因编码的蛋白变异。

单倍体P.恶性疟原虫基因组中藏着约60个不同的变种基因，其中只有一个被认为是转录每一次细胞在血液的感染阶段。如何实现这种相互排斥的变种基因的转录调控还不清楚，因为是个人var基因的鉴定或小组var基因与不同的受体和后果的差分结合的临床结果P.恶性疟原虫感染。近日，被称为相互排斥的转录模式提出了质疑，根据个人P.转录分析恶性疟原虫转录鉴定单INF的ected红细胞细胞利用RNA 荧光原位杂交（FISH）分析VAR的寄生虫P.单个核基因转录恶性疟原虫即^：1。

在这里，我们提出了一个详细的协议进行分析变种基因的转录的RNA-FISH方法在单核的P.恶性疟原虫感染人类的红细胞。该方法是基于对使用地高辛和生物素标记的反义RNA探针使用的TSA加荧光调色板系统^2（Perkin Elmer公司制），微观分析和新鲜选择P.恶性 IE浏览器。 原位杂交法可以用来监测转录的各种基因表达和调节过程中的不同阶段的P.恶性疟原虫生命周期和适应其他疟疾寄生虫物种和其他生物体和细胞类型。

研究方案

1。新选择受感染的红细胞的生成

对于这个测定法，获得最好的结果是当使用新鲜选择培养表面表达的PfEMP1蛋白。在这个特殊的实验3D7 P.恶性疟原虫谱系选择使用特定的抗体，如前面描述的^1。

第1天

1. 嘉实200μl的包装血细胞从P.恶性疟原虫培养含有2-5％的IE后期通过离心分离，在800×g离心8分钟，在室温下。
2. 血液沉淀重新悬浮在2毫升37°C预热0.75％明胶溶液在一个14毫升的无菌管中，并离开为15-20分钟，在37℃下，以允许未感染和环阶段IE泥沙。
3. 收获后期的IE， 即上层相，到一个新的14毫升的试管中，并用10ml的37℃的温水RBC清洗介质清洗两次。
4. 用50微升具体的反PfEMP稀释在2毫升37℃的温水RBC清洗媒体和无菌过滤器1抗体。
5. 灭菌的稀释抗血清在14毫升无菌试管中，并培育30分钟，37°C下缓慢搅拌混合水洗后期的IE。
6. 附带下降，在800×g离心8分钟，在室温下，并清洗两次，每次用10毫升37℃的温水RBC清洗介质。
7. 洗两次50μL的Dynabead蛋白的悬浮液，红细胞洗涤介质中使用DynaMaq-15磁铁。
8. 在300μl红细胞洗涤介质中重悬磁珠和他们洗过的后期IE。在37℃下孵育30分钟，温和搅拌。
9. 管转移到DynaMaq-15磁体。静置1-2分钟，取出所有的液体。
10. 重悬磁珠于4-5毫升的红细胞洗涤介质。管转移回上的磁铁，让它为1-2分钟前消除所有的液体。重复洗涤步骤一次。
11. 将洗过的小珠转移到一个25厘米²无菌培养fLASK含有200μl的新鲜堆积的红血细胞。添加5-6毫升Albumax媒体进入文化。存放过夜，在37℃下在5％CO _2的

第2天

12. 从文化当选定的的IE已经reinvaded的鲜红色的血细胞将所有的文化，一个14毫升的无菌试管中取出磁珠。将管到DynaMaq-15磁铁离开1-2分钟。然后，全部倒掉培养瓶中的液体倒回。
13. 尽可能为几个周期的5％至10％，直到原虫和寄生虫的文化是在ringstage。
14. IE应通过FACS分析，以确保正确的表面表型， 即蛋白表达的任一PFD1235w and/orPF11_0008已得到的^1。

2。探针制备

反义RNA探针产生的从最的可变区的PFD1235w和PF11_0008 变种</ em>的基因，P.恶性疟原虫 3D7基因组DNA。通过PCR扩增的DNA，并克隆到载体转录的pSPT18或19，分别根据制造商的说明（Roche公司）。使用地高辛RNA标记试剂盒RNA标记或生物素混合，分别与地高辛（DIG）或生物素标记探针（580个碱基对（bp）和590 bp的长度）。我们证实了特异性的探针，通过Northern印迹分析和由单一标签FISH分析^1。

3。薄涂片和固定在原位杂交中的寄生虫在此之前

第1天

所有的步骤被执行的无RNase的环境中，所有试剂无RNase的或预先用焦碳酸二乙酯（DEPC）或RNase扎普（Invitrogen公司）。载玻片和盖玻片应该用酒精清洗，以除去残留的制造油脂。重要的是要在各步骤之间没有任何暂停执行协议为了尽量减少核酸酶污染的风险。

1. 薄血膜的标准传播方法^3。使用油100倍的显微镜物镜，算上IE浏览器和IE浏览器中的百分比计算的文化。检查，寄生虫阶段是在近似的同步的，在环和早期滋养体阶段的IE周期。这些都是预先复制，单核阶段，表达var基因mRNA的和适合这种类型的单细胞FISH转录分析。
2. 50微升的寄生虫文化传输，在原虫的5-10％，以1.5毫升的无RNase的Eppendorf管中。在室温下以2,000 rpm离心1分钟。
3. 取出介质，并加入50μlPBS DEPC处理过的水的pH值为7.2。轻轻搅动管。离心沉淀步骤重复两次以洗涤细胞不受媒体和细胞碎片。
4. 四好品质的薄涂片。对于每一个涂抹，使涂抹于一个11毫米直径的4以及幻灯片， 即四在总的载玻片上，在一个无RNA酶罩（ 关键步骤 ）。波简要地滑动到空气中晾干。车型三个额外的任何其他的无关基因的单探针染色阴性对照 - 酮滑动滑动，通过使用特定的探头，另一个滑动核糖核酸酶处理和三分之一滑动含有IE不表达感兴趣的基因。留在板凳上干10-20分钟的幻灯片。
5. 修复的薄膜，通过添加60微升固定溶液含有4％多聚甲醛和5％冰醋酸入井。在室温下静置10分钟，在板凳上。
6. 通过温和搅拌5分钟，在室温下，在2×SSPE缓冲液洗净幻灯片。多余的液体接触的孔中的细胞，用纸巾轻轻取出。
7. 量的幻灯片0.01％的胃蛋白酶在0.01 M HCl 2分钟，在37°C（一个非常关键的一步）。洗5分钟，在室温下2个亚急性硬化性全脑炎中的幻灯片。
8. 的RNase溶液稀释至最终浓度为10微克/毫升。量的负控制涂片用60微升的RNase溶液。在37°C孵育30分钟，然后洗5分钟，在室温下2个亚急性硬化性全脑炎中的幻灯片。
9. 立即着手在杂交步骤。

4。杂交的RNA探针固定滑轨

第1天

1. 准备杂交室，作为温度感应器100 HC4的或空的移液管尖中放入干净的烘箱中，通过喷洒用RNase扎普和擦拭清洁用薄纸等。填充杂交室或用DEPC处理过的水，以使确保幻灯片不会干出期间杂交的框的底部的通道。关闭室和预热至48°C。
2. 稀释到杂交溶液至终浓度为12纳克/微升探针。变性的探针溶液在65℃的加热块中的5分钟。立即冰上冷却。
3. 简单地说晾干后2个亚急性硬化性全脑炎洗的幻灯片。孔周围用纸巾小心地除去过量的液体。
4. 打开杂交室，和室中的幻灯片。应用的总体积为60微升每孔中的一个或两个探针。一个无RNA酶的盖玻片，用无菌镊子小心地覆盖液滴。
5. 关闭腔，并在夜间至少​​16小时，在48°C杂交的幻灯片。

5。抗体共轭荧光扩增

第2天

下面的步骤是基于TSA Plus荧光调色板的系统从Perkin Elmer。所有的步骤都在室温下进行。

1. 洗净幻灯片的3倍TN​​T缓冲轻轻搅拌5分钟。
2. 井座TNB缓冲液150μl的30分钟。
3. 稀释的HRP共轭的α-DIG抗体1:100，HRP共轭的α-生物素抗体的比例在TNB的缓冲液中，在TNB缓冲区中的比率为1:500。用纸巾从幻灯片中删除任何多余的TNB缓冲。同时检测两个转录时，这两种抗体可以去一次。应用的抗体TNB的溶液，每孔加入100μl的总量，并小心地用盖玻片覆盖。孵育的幻灯片2小时。
4. 取出盖玻片仔细。洗净的幻灯片在TNT缓冲液3次，每次5分钟。
5. 在1:500的比例稀释的FITC-荧光团中的酪胺的扩增试剂，和应用的解决方案，每个孔中加入100μl。井用盖玻片覆盖，孵育12分钟。
6. 小心取出盖玻片，并用幻灯片3次，轻轻搅拌5分钟，TNT缓冲。
7. 在1:500的比例稀释Cyan3荧光团中的酪胺的扩增试剂。加入100μl每该溶液。井用盖玻片覆盖，孵育12分钟。
8. 取下盖子滑落仔细阅读，然后快速冲洗幻灯片，沉浸在TNT缓冲。
9. 幻灯片洗净3次，用TNT缓冲液5分钟。
10. 迅速在DEPC处理过的水浸泡幻灯片。
11. 离开幻灯片风干。安装防褪色试剂DAPI幻灯片。密封用指甲油的盖玻片的角部。
12. 现在准备用于显微镜的幻灯片。保持覆盖铝箔和存储的幻灯片，在4°C，如果实验是要完成的第二天。一个完整的密封的侧面的滑动，可以进行24小时后，施加的抗褪色试剂。这将允许被成像在幻灯片最多为一个星期后的协议已完成。

6。杂交探针的可视化

1. 打开显微镜上。一个标准的免疫荧光显微镜，够ient这种实验，但如果你有机会到激光共聚焦显微镜，你也可以使用这个3D图像或获得视频染色细胞。允许显微镜热身15-30分钟。接通计算机和软件。
2. 质量检查的染色，免疫荧光显微镜。选择一个点，其中包含一些寄生虫。
3. 手动调整每个激光器的增益。调整的像素停留4-6米^-1 s ^-1和512×512象素的步骤。
4. 测试图片使用框架拉姆达。调整激光的增益。
5. 以最低的20个好照片的荧光单细胞。需要至少有2-5个图片一个字段包含5-20寄生虫的阳性寄生虫的百分比，以获得一个公平的概述。

结果

图1示出的主要步骤的流程图，和持续时间的RNA FISH方法。

一系列有代表性的图像，保存差染mRNA的FISH实验采用单P.疟原虫 IE浏览器在图2中所示。细胞内的原虫有一个小的（1-1.5微米直径）的原子核，用DAPI染成蓝色。二十四小时后，红细胞的入侵P.恶性疟原虫裂殖过程中， 即细胞核分裂，就开始了。优化FISH检测的变种基因转...

讨论

RNA FISH分析，如Northern印迹和RT-PCR的方法，允许特定的mRNA转录在单细胞水平上的歧视。这使得有可能区分转录活性和非活动单元，在这个例子中，P.恶性疟原虫在人体红血细胞内寄生原虫。这种全细胞观察往往是必要的，并可能解开重要的和新颖的转录模式^1。

虽然其他RNA FISH的方法已被描述^4-10，出现了一个需要发展的一个新的和精致的协议，用于研究?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论
醋酸	适马/爱秩序	338826-100ML
Albumax媒体：RPMI 1640谷氨酰胺的解决方案	龙沙	BE12-115F	500毫升RPMI 1640 5毫升谷氨酰胺解决方案
Albumax媒体：硫酸庆大霉素Albumax的解决方案	龙沙	BE02-012E	2.5毫升硫酸庆大霉素 50毫升Albumax解决方案
Albumax解决方案：次黄嘌呤	Sigma-Aldrich公司	H9377	0.8克次黄嘌呤
Albumax溶液：AlbuMAX II	我nvitrogen	11021-037	200克Albumax
Albumax解决方案：RPMI 1640	龙沙	BE12-115F	4升RPMI 1640 与磁铁的最大溶解。 50°C。过滤消毒，分装储存在-20°C。
AMBERLITE	西格玛	A5710-110G	去离子甲酰胺树脂。
山羊多克隆抗生物素过氧化物酶结合物	Calbiochem公司	203206
抗地高辛抗体	诺伟司生物制品	NB100-41330
防褪色试剂DAPI	Invitrogen公司	P36931	安装媒体24 h后固化完全密封的滑动。
生物素RNA标记液	罗氏	11685597910
相机数码	尼康数码视线DC-F11
盖玻片	门泽尔 - 格拉泽	631-1570
培养瓶中，25厘米Nunclon表面	Nunc公司	156340
DEPC	Fluka公司/适马	32490-100ML	在1000毫升去 离子水DEPC1毫升。搅拌棒和搅拌12小时。高压灭菌30分钟。
数码相机	尼康数码视线DC-F11
磁珠蛋白A	Invitrogen公司	10002D
DynaMaq-15磁铁	Invitrogen公司	123-01D
甲酰胺bioultra 99％	Fluka公司/ SIGMA	47671-1L-F	去离子甲酰胺：5克每100毫升甲酰胺中的离子交换树脂。搅拌30分钟。通过Whatman滤纸过滤。
明胶75％的解决方案：明胶	Sigma-Aldrich公司	G2500	3.75克鱼胶片在500毫升的RPMI 1640。加热至56°C溶解。 56°C时，过滤消毒以等分试样在-20℃下储存。
明胶0，75％的溶液：RPMI 1640培养液	龙沙	BE12-115F	3.75克鱼胶片在500毫升的RPMI 1640。加热至56°C溶解。 56°C时，过滤消毒以等分试样在-20℃下储存。
谷氨酰胺的解决方案：L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich公司	G3126	在500毫升0.9％的氯化钠14.6克L谷氨酰胺。溶解，滤波器sterilize分装并储存在-20°C。
谷氨酰胺的解决方案：盐酸	西格玛	H1758	在500毫升0.9％的氯化钠14.6克L谷氨酰胺。溶解，过滤消毒，分装储存在-20°C。
杂交液：甲酰胺生物超99％SSC 20倍	Fluka公司/适马	47671-1L-F	共有20毫升，保持冷冻分装在-20°C 10毫升去离子甲酰胺
杂交液：登哈特的50倍的浓缩	西格玛	D2532	5毫升20xSSC
杂交的解决方案：的酵母tRNARoche阻断剂	西格玛	R-6750	2毫升50倍登哈特 250微升20毫克每毫升酵母tRNA
	Fluka公司/适马	31149-106GF	0.4克罗氏阻断剂 1毫升10毫克每毫升鲑鱼精子DNA（严重：在96℃下5分钟，然后加入到杂交溶液的变性鲑鱼spermDNA）
杂化温度感应器100 HC4	Quantifoil仪器公司	1004-0011	通过杂交烤箱和DEPC水填充的无RNA酶的杂交室可以被替换。
浸油UV透明的荧光自由	西格玛	10976-1EA
免疫荧光共聚焦显微镜	尼康D-Eclipse的TE2000C
Nailpolish	可在任何药店
PBS 20倍：氯化钠 氯化钾 的Na 2 HPO 4×2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC去离子H 2 O			ajust pH值至7.4 160克 4克 23克 4克 1升
多聚甲醛4％	Fluka公司/ CHEMIKA	76240	4克PFA 80毫升PBS / DEPC。加热到65°C，直到PFA溶解。加入20毫升PBS中，使溶液冷却。将pH调节至7.4。过滤器。分装存放在-20°C
多聚甲醛4％/酸醋酸5％			950微升多聚甲醛+ 50μL醋酸
胃蛋白酶	适马/爱秩序	P7000
过氧化物酶的共轭反生物素	Calbiochem公司	203206
红细胞洗涤介质：RPMI 1640谷氨酰胺解决方案	龙沙	BE12-115F	500毫升RPMI 16405毫升谷氨酰胺解决方案
红细胞洗涤介质：硫酸庆大霉素	龙沙	BE02-012E	2.5毫升硫酸庆大霉素
核糖核酸酶	适马/爱秩序		制作10毫克/毫升原液。
无RNA酶的1.5 ml管	Ambion公司	AM12450
核糖核酸酶扎普	Ambion公司	AM9780
幻灯片4口井11毫米	Thermo Scientific的	MENZXER306W
SSC 20倍：氯化钠	SIGMA /铝drich	S9625	3 M氯化钠（175克/升）的0.3M的Na 3柠檬酸x高2 O（88克/升），用1M HCl调节pH至7.0
SSC 20倍：柠檬酸钠脱水	适马/爱秩序	W302600	3 M氯化钠（175克/升）的0.3M的Na 3柠檬酸x高2 O（88克/升），用1M HCl调节pH至7.0
亚急性硬化性全脑炎20倍：氯化钠	适马/爱秩序	S9625	175.3克氯化钠
亚急性硬化性全脑炎20倍的NaH 2 PO 4	适马/爱秩序	S0751	27.6克的NaH 2 PO 4。
SSPE 20倍：4 EDTA粉			9.4克EDTA粉 加入DEPC水，调节pH值7.4。汽车劈好20分钟
TNB缓冲：TNT缓冲液			10毫升TNT缓冲
TNB缓冲液：封闭试剂			0.05克阻断剂 要封闭试剂溶解，溶液加热到60℃，在搅拌下的1小时。贮存于-20℃下（来源于Perkin Elmer公司TSA协议）。
TNT缓冲液：Tris / HCl中	西格玛	T1503	1M的Tris / HCl，pH值8.0
TNT缓冲液：氯化钠	Sigma Aldrich公司	S9625	百毫升
TNT缓冲液：吐温20	西格玛	93773	5 M氯化钠30毫升 1毫升DEPC蒸馏水2 O869毫升 调节pH至7.5，在室温下。 （来源于Perkin Elmer公司TSA协议）。
TSA加Cyanine3 /荧光系统	Perkin Elmer公司	NEL753000IKT	在实验开始前，请仔细阅读该协议从TSA Plus荧光调色板的系统。
管14毫升无菌	ALMECO - CM LAB APS	91016