ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

Summary

פלואורני באתר הכלאה (דגים) כדי לזהות תעתיקי mRNA בתאים בודדים מאפשרת ניתוח של פעילות polygenic כגון שעתוק סימולטני של חבר אחד או יותר של Var משפחת multigene ב Plasmodium falciparum אריתרוציטים נגועים ¹. הטכניקה ניתנת להתאמה, וניתן להשתמש בסוגים שונים של גנים, תאים ואורגניזמים.

Abstract

הידבקות של אריתרוציטים Plasmodium falciparum הנגועים (IE) לקולטנים אנדותל אדם במהלך זיהומי מלריה מתווכת על ידי ביטוי של PfEMP1 גרסות חלבונים המקודדות על ידי גני var.

הפלואידים פ falciparum הגנום מטפח כ 60 גני var שונים אשר אחד בלבד כבר האמינו שעבד לכל תא בכל פעם בשלב הדם של הזיהום. איך רגולציה סותרת כזה של שעתוק הגנים var מושגת לא ברור, כפי שהוא זיהוי גני var בודדים או תת קבוצות של גנים הקשורים לvar קולטנים שונים והתוצאה של מחייב הפרש בתוצאה הקלינית של פ זיהומי falciparum. לאחרונה, הפרדיגמה שעתוק מוציאות כבר נקראה בספק על ידי מבחני שעתוק המבוססים על פ פרט זיהוי תמליל falciparum בinf אחתתאי האריתרוציטים ected באמצעות רנ"א ניאון כלאה באתר (FISH) ניתוח של שעתוק הגנים var ידי הטפיל בגרעינים בודדים של פ falciparum ^1-IE.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע המתודולוגיה RNA-FISH לניתוח של שעתוק הגנים var בגרעינים בודדים של פ falciparum נגוע אריתרוציטים אדם. השיטה מבוססת על השימוש בdigoxigenin וביוטין שכותרתו RNA באמצעות בדיקות antisense TSA פלוס מערכת פלואורסצנטי פלטת ² (פרקין אלמר), ניתוחים מיקרוסקופים ונבחר טריים פ falciparum IE. בשיטת כלאה באתר ניתן להשתמש כדי לפקח על שעתוק ורגולציה של מגוון רחב של גנים הביע בשלבים השונים של פ מחזור חי falciparum וניתן להתאמה למינים אחרים מלריה טפיל ואורגניזמים אחרים וסוגי תאים.

Protocol

1. דור של אריתרוציטים הנגועים הנבחרים טרי

עבור assay זה, את התוצאות הטובות ביותר מתקבלות בעת שימוש בתרבויות שנבחרו זה עתה לביטוי פני PfEMP1 חלבון. בניסוי המסוים הזה 3D7 פ שושלת falciparum נבחרה באמצעות נוגדנים ספציפיים כמתואר ¹ בעבר.

יום 1

1. 200 μl הקציר של תאי דם ארוז מפ falciparum התרבות המכילה 2-5% אקספלורר שלב מאוחר על ידי צנטריפוגה XG ב 800 דקות ל8 בטמפרטורת חדר.
2. Re-להשעות גלולה בדם של 2 מ"ל 37 ° C 0.75% פתרון חם ג'לטין בצינור סטרילי 14 מ"ל, ולצאת לדקות 15-20 על 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר IE אינו הנגוע וטבעת שלבים למשקעים.
3. לקצור את IE בשלב מאוחר, כלומר את השלב העליון, לתוך צינור חדש מ"ל 14 ולשטוף פעמים עם 10 מ"ל של 37 ° C התקשורתיים חם RBC-שטיפה.
4. לדלל 50 μl של אנטי PfEMP הספציפי1 נוגדנים ב2 מ"ל של 37 ° C תקשורת RBC-לשטוף ולסנן סטריליים החמימה.
5. מערבב את IE השטוף בשלב מאוחר עם נסיובי עוקר בדילול המלא בצינור סטרילי 14 מ"ל ודגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
6. ספין למטה XG ב 800 דקות ל8 בטמפרטורת חדר, ולשטוף פעמים עם 10 מ"ל של 37 ° C התקשורתיים חם RBC-שטיפה.
7. שטוף 50 μl של חלבון Dynabead השעיה פעמים עם תקשורת RBC-שטיפה באמצעות-15 DynaMaq מגנט.
8. Resuspend את Dynabeads ב300 תקשורת μl RBC-לשטוף ולהוסיף אותם לאקספלורר השטוף בשלב מאוחר. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
9. העברת הצינור למגנט DynaMaq-15. השאר למשך 1-2 דקות ולהסיר את כל הנוזלים.
10. Resuspend את Dynabeads במיליליטר 4-5 המדיה RBC-שטיפה. העברת הצינור בחזרה אל המגנט ולהשאיר אותה במשך 1-2 דקות לפני ההסרה כל הנוזלים. חזור על שלב כביסת פעם אחת.
11. להעביר את החרוזים המכובסים לו 25 סנטימטרים ² סטרילי תרבותלאסק מכיל 200 תאי דם μl ארוז טרי אדומים. הוסף 5-6 מ"ל של Albumax תקשורת בתרבות. אחסן לילה בCO 5% ₂ ב 37 ° C.

יום 2

12. הסר את Dynabeads מהתרבות כאשר IE שנבחר פלישה חוזרת של תאי הדם האדומים הטריים על ידי העברה כל התרבות לצינור סטרילי 14 מ"ל. שים את הצינור אל-15 DynaMaq המגנט ולצאת ל1-2 דקות. לאחר מכן, שופך את כל הנוזל בחזרה לבקבוק התרבות.
13. תרבות לכמה שפחות מחזורים ככל האפשר עד parasitemia של 5-10% וטפילים הן בringstage.
14. אקספלורר צריך להיות מנותח על ידי FACS כדי לוודא שהפנוטיפ המשטח הנכון, ביטוי חלבון כלומר של או and/orPF11_0008 PFD1235w הושג ^1.

2. הכנת הבדיקות

בדיקות antisense RNA נוצרו מהאזורים המשתנים ביותר של PFD1235w וvar PF11_0008 </ Em> גנים מפ הדנ"א הגנומי 3D7 falciparum. דנ"א הוגבר באמצעות PCR ומשובט לתוך וקטור pSPT18 או 19 לשעתוק, בהתאמה לפי התיאור של היצרן (רוש). הבדיקות (580 זוגות בסיסים (bp) ו590 BP באורך) תויגו עם Digoxigenin (DIG) או ביוטין באמצעות DIG-RNA תיוג קיט או מיקס תיוג ביוטין רנ"א, בהתאמה. אנחנו אשרנו את הספציפיות של הבדיקות הן על ידי ניתוח כתם הצפון ועל ידי ניתוח יחיד, תווית דגי ^1.

3. למרוח דקים וקיבוע של טפילים לפני הכלאה באתר

יום 1

כל הצעדים נעשים בסביבת RNase-חופשיה וכל המגיבים הם RNase חינם או מראש טופל-עם diethyl pyrocarbonate (DEPC) או RNase Zap (Invitrogen). את השקופיות וחוטרי כיסוי יש לנקות עם אלכוהול כדי להסיר שומן ייצור שיורית. חשוב לבצע את הפרוטוקול ללא כל הפסקה בין צעדיםעל מנת למזער את הסיכון לזיהום nuclease.

1. לעשות סרט דם דק בשיטת ההפצה הסטנדרטית ^3. באמצעות העדשה אובייקטיבי שמן 100x של המיקרוסקופ, לספור את IE ולחשב את האחוז של IE בתרבות. בדקו ששלבי הטפיל הם בתיאום מקורב, בטבעת והשלבים מוקדמים של trophozoite מחזור IE. אלה הם mRNA הגן var להביע מראש שכפול, שלבים חד nucleate, ומתאים למבחנים בודדים סלולריים דגי שעתוק מסוג זה.
2. העברה 50 μl של התרבות הטפילה, בparasitemia של 5-10%, לצינור 1.5 מ"ל RNase ללא אפנדורף. צנטריפוגה לדקות 1 ב2000 סל"ד בטמפרטורת חדר.
3. הסר את המדיה ולהוסיף pH 50 μl PBS 7.2 במי DEPC טופל. להתסיס את הצינור בעדינות. חזור על שלב שקיעת צנטריפוגלי פעמים כדי לשטוף את התאים חינם מתקשורת ופסולת תא.
4. לעשות ארבע מריחות דקות באיכות טובה. לכל כתם, כתם להפוך לאחד אל11 קוטר מ"מ אחד הטוב של 4 שקופיות טובות, ארבע שקופיות זכוכית כלומר בסך הכל, במכסת מנוע RNase חינם (שלב קריטי). גל מחליק לרגע באוויר לייבוש. הפוך שלוש שקופיות נוספות לשקופית שלילית בקרות אחד להכתמת בדיקה אחת לכל גן רלוונטי אחר באמצעות בדיקה ספציפית, שקופית אחרת לטיפול RNase ושקופית המכילה 3 אקספלורר לא מבטא את הגן של עניין. השאר את השקופיות לייבוש על הספסל במשך 10-20 דקות.
5. תקן את הסרטים הדקים על ידי הוספת 60 μl של פתרון קיבעון המכיל paraformaldehyde 4% וחומצה אצטית קרחונים 5% לבארות. השאר למשך 10 דקות על הספסל בטמפרטורת חדר.
6. שטוף את השקופיות ב2x SSPE חיץ למשך 5 דקות על ידי תסיסה עדינה בטמפרטורת חדר. בקצרה סילוק נוזלים עודפים על ידי נגיעה בבארות המכילות את התאים בעדינות במגבת נייר.
7. לכסות את השקופיות עם פפסין 0.01% ב0.01 M HCl עבור 2 דקות על 37 מעלות צלזיוס (צעד מאוד קריטי). שטוף את השקופיות ב2x SSPE למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
8. לדלל את תמיסת RNase לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל. לכסות על כתמי בקרה השליליות עם 60 μl של פתרון RNase. דגירה במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף את השקופיות ב2x SSPE למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
9. פנה מייד לצעד ההכלאה.

4. כלאה של בדיקות RNA על שקופיות קבועות

יום 1

1. הכן קאמרי הכלאה, כגון ThermoStar 100 HC4 או תיבת קצה פיפטה ריקה לשים בתנור נקי, על ידי ריסוס עם RNase Zap ומנגב אותו נקי במגבת נייר. מלא את הערוצים של חדר ההכלאה או התחתון של התיבה עם מי DEPC טופל כדי לוודא שהשקופיות לא תתייבשנה במהלך הכלאה. סגור את החדר ומחמם עד 48 מעלות צלזיוס
2. לדלל את החקירות בפתרון ההכלאה לריכוז סופי של 12 ng / μl. לפגל פתרון החללית על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בבלוק חימום. מייד לצנן על קרח.
3. בקצרה אוויר תיבש את השקופיות אחרי כביסת SSPE 2x. מוציא בזהירות את הנוזל עודף סביב הבארות במגבת נייר.
4. פתח את תא ההכלאה ולמקם את השקופיות בבית הבליעה. תחול אחת או בשתי הבדיקות בהיקף כולל של 60 μl לטוב. זהירות לכסות טיפת הנוזל עם תלוש כיסוי RNase-חופשי באמצעות מלקחיים סטריליים.
5. סגור את התא ולהכליא את השקופיות ב48 מעלות צלזיוס במשך לפחות 16 שעות במשך הלילה.

5. נטיית נוגדן והגברת קרינה

יום 2

השלבים הבאים מבוססים על מערכת TSA פלוס פלטת קרינה מפרקין אלמר. כל הצעדים נעשים בטמפרטורת חדר.

1. שטוף את השקופיות 3 פעמים בTNT חיץ למשך 5 דקות עם תסיסה עדינה.
2. חסום את הבארות ב150 μl של חיץ TNB למשך 30 דקות.
3. לדלל את נוגדן HRP-מצומדות α-DIG במאגר TNB ביחס של 1:100 ונוגדן HRP-מצומדות α-ביוטין במאגר TNB, ביחס של 1:500. הסר את כל חיץ TNB עודף מהשקופיות עם ממחטת נייר. כאשר גילוי 2 תעתיקים בו זמנית, שני הנוגדנים יכולים ללכת מייד. למרוח כמות כוללת של 100 μl של פתרון נוגדן לTNB היטב ולכסות בזהירות עם פתק כיסוי. דגירת השקופיות עבור 2 שעות.
4. הסר את התלושים לכסות בזהירות. שטוף את השקופיות בTNT חיץ 3 פעמים למשך 5 דקות.
5. דלל את FITC-fluorophore בריאגנט ההגברה tyramide ביחס של 1:500 ולהחיל 100 μl של פתרון לכל באר. לכסות את הבארות עם תלושי כיסוי ודגירה במשך 12 דקות.
6. הסר את המכסה מחליק בזהירות ולשטוף את השקופיות 3 פעמים למשך 5 דקות בחיץ TNT ידי תסיסה עדינה.
7. דלל את Cyan3-fluorophore בריאגנט ההגברה tyramide ביחס של 1:500. הוסף לμl 100גם בפתרון זה. לכסות את הבארות עם תלושי כיסוי ודגירה במשך 12 דקות.
8. הסר את המכסה מחליק בזהירות ולאחר מכן לשטוף את השקופיות במהירות על ידי טבילה בחיץ TNT.
9. שטוף את השקופיות 3 פעמים עם חיץ TNT למשך 5 דקות.
10. לטבול את השקופיות במהירות במי DEPC טופל.
11. השאר את השקופיות לייבוש באוויר. הר את השקופיות עם ריאגנט אנטי לדעוך מכיל DAPI. לאטום את הפינות של תלושים לכסות עם לק.
12. את השקופיות מוכנות כעת למיקרוסקופיה. שמור את השקופיות מכוסות בנייר האלומיניום ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס, אם הניסוי הוא להסתיים ביום למחרת. איטום מלא של הצדדים של השקופיות יכול להתבצע 24 שעות לאחר ההחלה מגיבה נגד הדהייה. זה יאפשר את השקופיות שצלמו עד שבוע לאחר הפרוטוקול הושלם.

6. ויזואליזציה של בדיקות הכלאה

1. הפעל מיקרוסקופ. מיקרוסקופ immunofluorescence סטנדרטי הוא sufficient לסוג זה של ניסוי, אבל אם יש לך גישה למיקרוסקופ confocal אתה יכול גם להשתמש בזה לתמונות 3D או כדי לקבל קטעי וידאו של התאים המוכתמים שלך. אפשר מיקרוסקופ כדי להתחמם במשך 15-30 דקות. כבה את המחשב ואת התוכנה.
2. בדקו את איכות הצביעה במיקרוסקופ immunofluorescence. בחר מקום המכיל כמה טפילים.
3. התאם את הרווח של כל ליזר באופן ידני. התאם פיקסל להתעכב כדי 4-6 מ ^'-1 של ^-1 והצעדים ל512 x 512 פיקסלים.
4. קח תמונת בדיקה באמצעות המסגרת למבדה. להסתגל רווח הליזר.
5. קח מינימום של 20 תמונות טובות של תאים בודדים ניאון. לפחות 2-5 תמונות של שדה המכיל 5-20 טפילים נדרשות על מנת לקבל סקירה הוגנת של אחוז הטפילים חיוביים.

תוצאות

איור 1 מדגים תרשים זרימה של השלבים העיקריים ומשך הזמן של המתודולוגיה דגי רנ"א.

סדרה של תמונות מייצגות של ניסויים וגם גרועים השתמרו מוכתמים mRNA דגים באמצעות פ אחת falciparum אקספלורר מוצגים באיור 2. protozoan הת...

Discussion

ניתוח דגי רנ"א, בניגוד לשיטות כמו סופג צפון וRT-PCR, מאפשר אפליה של תעתיקי mRNA ספציפיים ברמת התא הבודדה. זה מאפשר להבחין בין תאי תעתיק פעילים ולא פעילים, בדוגמה זו, פ falciparum הטפיל פרוטוזואה בתוך תאי דם אדומים אנושיים. תצפיות כאלה כל תא הן לעתים הכרחיות ויכולות לחשוף ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
חומצה אצטית	סיגמא / אולדריץ	338826-100 מ"ל
Albumax מדיה: 1640 פתרון גלוטמין RPMI	Lonza	BE12-115F	500 המ"ל RPMI 1640 פתרון 5 מ"ל גלוטמין
Albumax תקשורת: Gentamycin גופרת Albumax-פתרון	Lonza	BE02-012E	2.5 מ"ל gentamycin גופרה 50 מ"ל Albumax-פתרון
Albumax-פתרון: Hypoxanthine	סיגמה אולדריץ	H9377	0,8 גרם Hypoxanthine
Albumax-פתרון: AlbuMAX השני	אניnvitrogen	11021-037	200 גרם Albumax
Albumax-פתרון: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 הליטר RPMI 1640 ממס עם מגנט במקסימום. 50 ° C. סנן לעקר ולאחסן ב -20 ° C בaliquots.
Amberlite	סיגמא	A5710-110g	שרף לdeionize פוראמיד.
הצמוד peroxidase אנטי ביוטין עז PAB	Calbiochem	203206
נוגדן אנטי Dig	נובוס ביולוגי	NB100-41330
ריאגנט אנטי לדעוך עם DAPI	Invitrogen	P36931	תקשורת ההרכבה יש לרפא עבור 24 שעות לפני שהוא סגר את השקופית לחלוטין.
ביוטין רנ"א תיוג מיקס	רוש	11685597910
מצלמה דיגיטלית	מראה דיגיטלי ניקון DC-F11
Coverslips	מנזל-גלזר	631-1570
25 משטח תרבות בקבוק 2 סנטימטר Nunclon	Nunc	156340
DEPC	Fluka / סיגמא	32490-100 מ"ל	1 המ"ל DEPC במי 1000 מ"ל deinonized. הוסף בר מערבבים ומערבבים במשך 12 שעות. חיטוי למשך 30 דקות.
מצלמה דיגיטלית	מראה דיגיטלי ניקון DC-F11
חלבון Dynabeads	Invitrogen	10002D
מגנט DynaMaq-15	Invitrogen	123-01D
פוראמיד bioultra 99%	Fluka/ סיגמא	47671-1l-F	פוראמיד deionized: 5 גרם של שרף חילוף יונים לכל 100 מ"ל של פוראמיד. מערבב 30 דקות. לסנן דרך נייר Whatman.
. ג'לטין 0 75% פתרון: ג'לטין	סיגמה אולדריץ	G2500	3.75 גר 'ג'לטין 500 המ"ל בRPMI 1640. חום עד 56 מעלות צלזיוס להמסה. סנן לעקר כאשר 56 ° C. חנות ב -20 ° C בaliquots.
. ג'לטין 0 75% פתרון: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3.75 גר 'ג'לטין 500 המ"ל בRPMI 1640. חום עד 56 מעלות צלזיוס להמסה. סנן לעקר כאשר 56 ° C. חנות ב -20 ° C בaliquots.
פתרון גלוטמין: L-glutamin	סיגמה אולדריץ	G3126	14.6 גלוטמין גרם לליטר ב500 מ"ל 0,9% NaCl. להתמוסס, מסנן שלterilize ולאחסן ב -20 ° C בaliquots.
פתרון גלוטמין: HCl	סיגמא	H1758	14.6 גלוטמין גרם לליטר ב500 מ"ל 0,9% NaCl. להתמוסס, לסנן לעקר ולאחסן ב -20 ° C בaliquots.
פתרון הכלאה: פוראמיד ביו אולטרה 99% SSC 20x	Fluka / סיגמא	47671-1l-F	סה"כ 20 מ"ל, לשמור קפוא ב -20 ° C בaliquots 10 פוראמיד deionized מ"ל
פתרון הכלאה: התרכיז של 50x Denhardt	סיגמא	D2532	20xSSC 5 מ"ל
פתרון הכלאה: ריאגנט שמרים tRNARoche חסימה	סיגמא	R-6750	2 מ"ל של 50x Denhardt 250 20 מ"ג למ"ל μl שמרי tRNA
פתרון הכלאה: DNA זרע הסלמון	Fluka / סיגמא	31149-106GF	0.4g רוש חסימת מגיב 1 מ"ל של 10 מ"ג לכל דנ"א זרע סלמון מ"ל (קריטי: לפגל הסלמון spermDNA בגיל 96 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני שמוסיף לפתרון ההכלאה)
מכליא ThermoStar 100 HC4	Quantifoil המכשירים GmbH	1004-0011	יכול להיות מוחלף על ידי תאי הכלאה חופשיות RNase מרופדים במי DEPC תנור הכלאה ו.
טבילת שמן UV שקוף פלואורסצנטי חופשי	סיגמא	10976-1EA
מיקרוסקופ immunofluorescence או confocal	ניקון D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	ניתן להשיג בכל בית מרקחת
PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deionized H 2 O			pH Ajust ל -7.4 160 גרם 4 גרם 23 גרם 4 גרם 1 הליטר
Paraformaldehyde 4%	Fluka / chemika	76240	4 גרם PFA ב80 המ"ל PBS / DEPC. חום עד 65 מעלות צלזיוס עד שPFA נמס. הוסף 20 המ"ל PBS, מאפשר הפתרון לצינון. התאם את ה-pH ל -7.4. לסנן. חנות בaliquots ב -20 ° C.
Paraformaldehyde 4% / חומצה אצטית 5%			950 paraformaldhyde μl + 50 חומצה אצטית μl
עכלן	סיגמא / אולדריץ	P7000
מצומדות peroxidase אנטיביוטין	Calbiochem	203206
RBC-לשטוף מדיה: 1640 פתרון גלוטמין RPMI	Lonza	BE12-115F	500 1640 פתרון מיליליטר RPMI 5 מ"ל גלוטמין
RBC-לשטוף תקשורת: סולפט Gentamycin	Lonza	BE02-012E	2.5 מ"ל gentamycin גופרה
RNase	סיגמא / אולדריץ		הפוך פתרון מניית מ"ל 10 מ"ג /.
1.5 צינור RNase החופשי מ"ל	Ambion	AM12450
RNase Zap	Ambion	AM9780
שקופיות 4 בארות 11mm	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	סיגמא / אלהיידריך	S9625	M 3 NaCl (175 גר '/ ליטר) 0.3M Na 3 ציטראט x H 2 O (88 ג'/ ליטר) התאם ל -7.0 pH עם 1M HCl
SSC 20x: מייבשי ציטראט נתרן	סיגמא / אולדריץ	W302600	M 3 NaCl (175 גר '/ ליטר) 0.3M Na 3 ציטראט x H 2 O (88 ג'/ ליטר) התאם ל -7.0 pH עם 1M HCl
SSPE 20x: NaCl	סיגמא / אולדריץ	S9625	175.3 גרם NaCl
SSPE 20x: Nah 2 PO 4	סיגמא / אולדריץ	S0751	27.6 גרם לאא 2 PO 4.
SSPE 20x: 4 EDTA אבקה			9.4 גרם אבקת EDTA מוסיף מי DEPC, להתאים pH 7.4. אוטומטיClave ל20 דקות
TNB חיץ: TNT חיץ			10 מ"ל TNT חיץ
TNB חיץ: ריאגנט חסימה			מגיב חסימת 0.05g כדי לפזר את מגיב החסימה, מחמם את התמיסה ל 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם ערבוב. חנות ב -20 ° C. (נגזר פרקין אלמר TSA-הפרוטוקול).
TNT חיץ: טריס / HCl	סיגמא	T1503	1M טריס / HCl, 8.0 pH
TNT חיץ: NaCl	סיגמה אולדריץ	S9625	100 מ"ל
TNT חיץ: Tween20	סיגמא	93773	5 M NaCl 30 מ"ל 1 המ"ל DEPC DH 2 O869 מ"ל התאם pH ל -7.5 בטמפרטורת חדר. (נגזר פרקין אלמר TSA-הפרוטוקול).
TSA בתוספת מערכת Cyanine3 / fluorescein	פרקין אלמר	NEL753000IKT	קראו את הפרוטוקול מTSA פלוס מערכת פלטת פלואורסצנטי בקפידה לפני תחילת הניסוי.
צינורות 14 מיליליטר סטרילי	Almeco - Aps LAB CM	91016