RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Özet

Floresan In situ hibridizasyon (FISH) bu tür birden fazla üyesinin eşzamanlı olarak transkripsiyon aktivitesi polijenik analizinin yapılmasını mümkün kılar Var Multigen aile Plasmodium falciparum Enfekte eritrositler ¹. Bu teknik uyarlanabilir ve genler, hücreler ve organizmalar farklı türlerde kullanılır.

Özet

Sıtma enfeksiyonları sırasında insan endotel reseptörlerine Plasmodium falciparum enfekte eritrositler (IE) Yapışma var genler tarafından kodlanan PfEMP1 protein varyantları ifade aracılık etmektedir.

Haploid P. falciparum genom tek bir enfeksiyonun kan aşaması sırasında her defasında hücre başına transkribe olduğu düşünülmektedir edilmiş olan yaklaşık 60 farklı var genler barındırır. Nasıl var gen transkripsiyonu gibi birbirini dışlayan düzenleme elde edilir belirsizdir, bireysel var genleri veya P. klinik sonuçlar üzerinde farklı reseptörleri ve diferansiyel bağlama sonucu ile ilişkili var genlerin alt gruplarının tanımlanmasıdır falciparum enfeksiyonlar. Son zamanlarda, birbirini dışlayan transkripsiyon paradigması bireysel P. esas transkripsiyon analizleri ile şüphe içine adı olmuştur Tek inf içinde falciparum transkript tespitiP. bireysel çekirdeklerinde parazit var gen transkripsiyonu in situ hibridizasyon RNA floresan kullanarak ected eritrotik hücreleri (FISH) analizi falciparum IE ^1.

Burada, P. tek-çekirdekleri var in gen transkripsiyonu analizi için RNA FISH yöntemi gerçekleştirmek için bir protokol ayrıntılı sunmak falciparum insan eritrosit etkilemiştir. Yönteminin kullanımını esas digoxigenin-ve TSA Artı Flüoresans Palet Sistemi ² (Perkin Elmer), mikroskopik analiz ile taze seçilmiş S. antisens RNA probları kullanılarak biyotin-etiketli falciparum IE. In situ hibridizasyon metodu ile de P. farklı aşamaları sırasında ifade edilen genlerin transkripsiyonu ve çeşitli düzenleme izlemek için kullanılabilecek falciparum yaşam döngüsü ve diğer sıtma parazit türlerinin ve diğer organizmalar ve hücre tipleri uyarlanabilir.

Protokol

1. Taze Seçilen Enfekte Eritrositler Nesil

PfEMP1 proteininin yüzeyde ekspresyonu için seçilen taze kültür kullanılarak, bu test için, en iyi sonuçlar elde edilir. Bu özel deney 3D7 P. falciparum soyu önce ¹ açıklandığı gibi spesifik antikorlar kullanılarak seçildi.

1. Gün

1. Bir S. dan paketlenmiş kan hücrelerinin hasat 200 ul falciparum kültürü oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj ile% 2-5 geç safha IE içeren.
2. 37. 2 ml kan pelet yeniden askıya ° C sıcak% 0.75 jelatin bir steril 14 ml tüp içinde çözelti ve tortu ile enfekte olmamış ve halka-aşamalı IE izin vermek için 37 ° C sıcaklıkta 15-20 dk için bırakın.
3. Son aşama IE hasat etmek, yeni bir 14 ml tüp içine, üst faz, yani, 37 ° C sıcak RBC-yıkama ortamı 10 mL ile iki kez yıkanır.
4. Belirli bir anti-PfEMP 50 ul seyreltin37 2 ml ° C sıcak RBC yıkama medya ve steril filtre 1 antikorları.
5. 37, 30 dakika boyunca 14 ml steril tüp ile inkübe steril seyreltilmiş antiserumlar ° hafif ajitasyon ile C ile yıkanmış son aşama IE karıştırın.
6. Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 800 xg'de aşağı Spin, ve 37 ° C'de sıcak bir RBC-yıkama ortamı 10 mL ile iki kez yıkanır.
7. Bir DynaMaq-15 mıknatıs kullanarak RBC-yıkama medya ile bir süspansiyon kez Dynabead Protein 50 ul yıkayın.
8. 300 ul RBC yıkama medya Dynabeads süspanse ve yıkanmış geç evre IE ekleyebilirsiniz. Nazik çalkalama ile 37 ° C 'de 30 dakika süre ile inkübe edin.
9. DynaMaq-15 mıknatıs tüp aktarın. 1-2 dakika bırakın ve tüm sıvı kaldırmak.
10. RBC-yıkama ortamı 4-5 ml Dynabeads yeniden süspanse edin. Mıknatıs üzerine tüpü geri aktarın ve tüm sıvı çıkarmadan önce 1-2 dakika bekletin. Kez yıkama adımı yineleyin.
11. 25 cm ² steril kültür f yıkanmış boncuklar aktarın200 ul taze paketlenmiş kırmızı kan hücreleri içeren LASK. Kültürün içine Albumax medyanın 5-6 ml ekleyin. _37% 5 CO2 de bir gece ° C'de saklayın

2. Gün

12. Seçilen IE bir steril 14 ml tüp için tüm kültür aktararak taze kırmızı kan hücreleri reinvaded olan kültürden Dynabeads çıkarın. DynaMaq-15 mıknatıs üzerine tüpü koyun ve 1-2 dakika bekletin. Daha sonra, bir kültür şişesine tüm sıvı geri dökülür.
13. Olduğunca az% 5-10 parazitemi kadar mümkün olduğunca döngüleri ve parazitler için Kültür ringstage altındadır.
14. IE doğru yüzey fenotipini ya PFD1235w and/orPF11_0008 yani protein ekspresyonu ¹ elde edilmiştir emin olmak için FACS tarafından analiz edilmelidir.

2. Sondalar hazırlanması

Antisense RNA probları PFD1235w ve PF11_0008 var olan en değişken bölgelerin elde edildi <P. den / em> genler falciparum 3D7 genomik DNA. DNA, üreticinin tanım (Roche) 'ye göre, sırasıyla, PCR ile amplifiye edilir ve transkripsiyon için pSPT18 vektör ya da 19 içine klonlandı. Sondalar (580 baz çifti (bp) ve uzunluğu 590 bp) sırasıyla DIG RNA etiketleme Kiti veya Biyotin RNA etiketleme Mix kullanarak digoxigenin (DIG) veya Biyotin ile işaretlendi. İkimiz de Northern blot analizleri ile ve tek etiketli FISH analizi ¹ ile probların özgüllüğü doğruladı.

3. İn Situ Hibridizasyon İnce Smear ve öncesinde Parazitler Fiksasyon

1. Gün

Tüm adımlar RNase içermeyen bir ortamda gerçekleştirilir ve tüm reaktifler RNase içermeyen ya da dietil pyrocarbonate (DEPC) ya da RNaz Zap (Invitrogen) ile önceden tedavi edilen vardır. Slaytlar ve kapak camları artık üretim gres kaldırmak için alkol ile temizlenmelidir. Bu adımlar arasında herhangi bir duraklama olmadan protokolü gerçekleştirmek için önemlidirnükleaz kontaminasyon riskini en aza indirmek için.

1. Standart yayma yöntemi ³ ile ince bir kan film yapın. Mikroskop 100x yağı objektif lens kullanarak IE saymak ve kültür IE yüzdesi hesaplanır. Parazit aşamalarını halka ve IE döngüsünün erken trofozoit aşamalarında, yaklaşık senkronize olduğunu kontrol edin. Bu ön-çoğaltma, tek çekirdekli aşamaları, ifade var gen mRNA ve bu tip tek bir hücre FISH transkripsiyon testleri için de uygundur.
2. 1.5 ml RNaz ücretsiz Eppendorf tüp,% 5-10 parazitemi de, parazitin kültür 50 ul aktarın. Oda sıcaklığı altında 2.000 rpm hızında 1 dakika için santrifüjleyin.
3. Ortamı çıkarın ve DEPC-işlenmiş su 50 ul PBS pH 7.2 ekleyin. Tüpü yavaşça çalkalayın. Medya ve hücre artıkları ücretsiz hücreleri yıkamak için iki santrifüj sedimantasyon adımı yineleyin.
4. Dört kaliteli ince smear olun. Her smear için, üzerine bir karalama yapmakiyi bir RNaz ücretsiz kaputu bir 4 sıra slayt, toplam yani dört cam slaytlar, (önemli bir adım) biri 11 mm çapında. Dalga kuru havaya kısaca kayar. Belirli bir prob, RNaz tedavi ve ilgilenilen genin ifade IE içeren üçüncü bir slayt için başka bir slayt kullanarak başka alakasız gen için tek prob boyama için kontroller-bir negatif slayt için üç ekstra slaytlar olun. 10-20 dakika tezgah üzerinde kurumasına slaytlar bırakın.
5. Kuyu içine% 4 paraformaldehid ve% 5 asetik asit içeren, tespit solüsyonu 60 ul ilave edilerek ince filmlerin düzeltildi. Oda sıcaklığında, tezgah üzerinde 10 dakika bekletin.
6. , Oda sıcaklığında nazik çalkalama ile 5 dakika için 2 x SSPE tampon içinde slaytlar yıkayın. Kısaca bir kağıt mendille hafifçe hücreleri içeren kuyular dokunarak aşırı sıvı kaldırmak.
7. 37 ° C'de (çok önemli bir adım 2 dakika süreyle, 0.01 M HCl içinde% 0.01 pepsin ile slaytlar Kapak). Oda sıcaklığında 5 dakika için 2 x SSPE, slaytları yıkayın.
8. 10 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar, RNaz çözeltisi ile seyreltilir. RNaz solüsyonu 60 ul ile negatif kontrol yayma kaplayın. 37 ° C de 30 dakika inkübe ve daha sonra da oda sıcaklığında 5 dakika için 2 x SSPE, slaytları yıkayın.
9. Hibridizasyon adımı hemen geçin.

4. Sabit Slaytlara RNA problar Hibritleşmesi

1. Gün

1. Böyle bir Thermostar 100 HC4 veya RNaz Zap ile püskürtme ve bir kağıt mendille silerek temizleyin, temiz bir fırın koymak boş bir pipet ucu kutusu olarak hibridizasyon odasının, hazırlayın. Hibridizasyon odasının veya slaytlar hibridizasyon sırasında kurumasına olmayacak emin olmak için DEPC-işlenmiş su ile kutunun alt kanalları doldurun. 48 odası ve ön ısıtma kapatın ° C.
2. 12 ng / ul nihai konsantrasyon için hibridizasyon probları çözelti içine seyreltilir. Bir ısıtma bloğu içinde 5 dakika için 65 ° C sonda çözelti denatüre. Hemen buz üzerinde soğutun.
3. Kısaca hava 2x SSPE yıkamadan sonra slaytları kurulayın. Dikkatlice bir kağıt mendille kuyu çevresinde aşırı sıvı kaldırmak.
4. Hibridizasyon odasının açın ve odasında slayt yerleştirin. Bir ya da kuyu başına 60 ul toplam hacim içinde, her iki sensör uygulanır. Dikkatlice steril forseps kullanarak bir RNaz içermeyen kapak kayma ile sıvı damlası kapsamaktadır.
5. Oda kapatın ve gece boyunca en az 16 saat süreyle 48 ° C 'de slaytlar melezleşir.

5. Antikor Konjugasyon ve Floresans Amplifikasyon

2. Gün

Aşağıdaki adımları Perkin Elmer dan TSA Artı Flüoresans Palet sistemi dayanmaktadır. Tüm adımlar oda sıcaklığında yapılır.

1. Nazik ajitasyon ile 5 dakika boyunca TNT tampon slaytlar 3 kere yıkayın.
2. 30 dakika için TNB tampon 150 ul kuyu Blok.
3. 1:500 oranında, TNB tamponu içinde 1:100 'lük bir oran ile HRP-eşlenikli α-biotin antikor de TNB tampon içinde HRP-eşlenikli α-DIG antikoru seyreltilir. Bir kağıt mendille slaytlar emdiği TNB tampon çıkarın. Aynı anda iki transkript tespit edildiğinde her iki antikor seferde gidebilirsiniz. Kuyu başına antikor-TNB çözeltisinden 100 ul toplam miktar uygulanır ve dikkatli bir şekilde bir kapak slipi ile kaplayın. 2 saat için slaytlar inkübe edin.
4. Dikkatle kapak camları çıkarın. 5 dakika boyunca 3 kez TNT tampon slaytlar yıkayınız.
5. 1:500 oranında tyramide amplifikasyon reaktif içinde FITC-fluorofor seyreltilir ve her oyuğa 100 ul çözelti uygulanır. Kapağı makbuzları ile kuyu örtün ve 12 dakika inkübe edilir.
6. Dikkatlice kapağı fişleri çıkarın ve yavaşça sallanarak TNT tamponu içinde 5 dakika boyunca slaytlar 3 kere yıkayın.
7. 1:500 oranında tyramide amplifikasyon reaktif olarak Cyan3-fluorofor seyreltilir. Başına 100 ul ekleyinBu çözüm de. Kapağı makbuzları ile kuyu örtün ve 12 dakika inkübe edilir.
8. Kapağını çıkarın dikkatli kayıyor ve sonra TNT tampon batırılarak hızla slaytlar durulayın.
9. 5 dk için TNT tampon ile slaytlar 3 kere yıkayın.
10. DEPC-işlenmiş su hızlı bir şekilde slaytlar daldırın.
11. Kurumaya slaytlar bırakın. DAPI içeren anti-solmaya reaktifi ile slaytlar monte edin. Oje ile kapak camları köşelerinde mühürleyin.
12. Slaytlar artık mikroskopi için hazırız. Ol 4'te alüminyum folyo ile kaplanmış ve mağaza slaytlar ° C deney ertesi gün tamamlanması için ise. Slaytlar iki tam bir sızdırmazlık solmaya karşı reaktif uygulamadan sonra 24 saat üzerinden gerçekleştirilebilir. Bu protokol tamamlandıktan sonra, slaytlar bir hafta için yansıma sağlar.

6. Melezleşmiştir Sondalar Görselleştirme

1. Mikroskop açın. Standart bir immünofloresan mikroskop suffic olduğunuEğer bir konfokal mikroskop erişiminiz varsa deney bu tür ient, ama aynı zamanda 3D görüntüleri için kullanabilirsiniz ya da boyanmış hücrelerin videolar elde etmek. Mikroskop 15-30 dakika ısınmasını bekleyin. Bilgisayar ve yazılım açın.
2. Immünofloresan mikroskop boyama kalitesini kontrol edin. Birkaç parazitler içeren bir nokta seçin.
3. Elle her lazerin kazanç ayarlayın. Piksel 4-6 m ^-1 s ^-1 ve 512 x 512 piksel adımları yaşamak ayarlayın.
4. Çerçeve Lambda kullanarak bir test resim çekin. Lazer kazanç yeniden ayarlayın.
5. Floresan tek hücre 20 iyi resimler en az atın. 5-20 parazitler içeren bir alanda en az 2-5 fotoğraf pozitif parazitlerin yüzdesi adil bir bakış elde etmek için gereklidir.

Sonuçlar

Şekil 1, büyük adımlar ve RNA FISH yöntemin zaman süresinin bir akış şeması gösterilmektedir.

Tek P. kullanarak iyi ve kötü korunmuş lekeli mRNA BALIK deneyler temsili görüntüleri bir dizi falciparum IE Şekil 2 'de gösterilmiştir. Bu intrasellüler protozoon DAPI ile mavi lekeli bir küçük (1-1.5 mikron çapında) çekirdeğe sahip. Yirmi dört saat P. eritrosit işgalinden sonra falciparum schizo...

Tartışmalar

RNA FISH analizi, bu gibi Northern blot ve RT-PCR gibi yöntemlerin tersine, tek bir hücre düzeyinde spesifik mRNA transkriptlerinin ayrımı izin verir. Bu, P., bu örnekte, bu mümkün transkripsiyonel olarak aktif ve aktif olmayan hücreler arasında ayrım yapan falciparum parazitik insan kırmızı kan hücreleri içinde protozoa. Böyle tam hücreli gözlemler genelde gereklidir ve önemlidir ve roman transkripsiyonel desenler ¹ çözülmeye olabilir.

Di?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Asetik asit	Sigma / Aldrich	338826-100ml
Albumax medya: RPMI 1640 Glutamine çözümü	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml çözelti glutamin
Albumax medya: Gentamisin sülfat Albumax-çözüm	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamisin sülfat 50 ml Albumax çözelti
Albumax çözelti: Hipoksantin	Sigma-Aldrich	H9377	0,8 g Hipoksantin
Albumax çözelti: AlbuMAX II	Bennvitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax çözelti: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 litre RPMI 1640 Max mıknatıslı çözülür. 50 ° C. Filtre sterilize ve alikotları -20 ° C'de saklayın.
Amberlit	Sigma	A5710-110G'nin	Formamid Deiyonize için Reçine.
Anti-biotin keçi pAb Peroksidaz Konjugat	Calbiochem	203206
Anti-Dig antikoru	Novus Biyolojik	NB100-41330
DAPI ile Anti-solmaya reaktifi	Invitrogen	P36931	Montaj medya tamamen slayt sızdırmazlık önce 24 saat boyunca tedavi vardır.
Biotin RNA Etiketleme Mix	Roche	11685597910
Kamera dijital	Nikon dijital görme DC-F11
Lameller	Menzel-Glaser	631-1570
kültürü şişesi 25 cm 2 Nunclon yüzey	Nunc	156340
DEPC	Fluka / Sigma	32490-100ml	1000 ml su içinde deinonized 1 mL DEPC. Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve 12 saat için karıştırın. 30 dakika süreyle otoklav.
Dijital fotoğraf makinesi	Nikon dijital görme DC-F11
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Mıknatıs	Invitrogen	123-01D
Formamid bioultra 99%	Fluka/ Sigma	47671-1l-F	Deiyonize formamid: formamid 100 ml iyon değiştirme reçinesi 5 g. 30 dakika karıştırın. Whatman kağıt süzülür.
. Jelatin 0 75% çözüm: Jelatin	Sigma-Aldrich	G2500	500 ml RPMI 1640 içerisinde 3.75 g jelatin. 56 Isı ° C eritin. Zaman 56 ° C sterilize Filtre Alikots içinde -20 ° C'de saklayın.
. Jelatin 0 75% çözüm: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 içerisinde 3.75 g jelatin. 56 Isı ° C eritin. Zaman 56 ° C sterilize Filtre Alikots içinde -20 ° C'de saklayın.
Glutamin çözüm: L-glutamin	Sigma-Aldrich	G3126	500 ml% 0,9 NaCl içinde 14,6 g L glutamin. Dağılma, filtre sterilize ve alikotları -20 ° C'de saklayın.
Glutamin çözüm: HCl	Sigma	H1758	500 ml% 0,9 NaCl içinde 14,6 g L glutamin. Dağılma, sterilize filtre ve alikotları -20 ° C'de saklayın.
Hibritleşme çözüm: Formamid Bio ultra% 99 SSC 20x	Fluka / Sigma	47671-1l-F	Toplam 20 ml -20 donmuş tutmak ° C alikotları 10 ml deiyonize formamid
Hibritleşme çözüm: Denhardt kullanıcısının 50x konsantresi	Sigma	D2532	5ml 20xSSC
Hibritleşme çözüm: Maya tRNARoche engelleme reaktif	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt sitesi Ml maya tRNA başına 250 ul 20 mg
Hibridizasyon çözümü Trong	Fluka / Sigma	31149-106GF	0,4 g Roche reaktif engelleme Ml somon spermi DNA başına 10 mg (: denatüre somon spermDNA 96 5 dakika için ° C hibridizasyon çözeltisi ilave edilmeden önce Kritik) 1 mL
Hybridizer Thermostar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Hibridizasyon fırın ve DEPC su ile doldurulur RNaz ücretsiz hibridizasyon odaları tarafından değiştirilebilir.
Daldırma yağı UV şeffaf floresans ücretsiz	Sigma	10976-1EA
İmmünofloresan veya konfokal mikroskop	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	Herhangi bir eczane mevcuttur
PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deiyonize H 2 O			PH 7.4 'e Ajust 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldehyde 4%	Fluka / Chemika	76240	80 ml PBS / DEPC içinde 4 g PFA. PFA eriyene ° C kadar 65 Isı. 20 ml PBS ekleyin, çözüm soğumasını bekleyin. PH 7.4 'e ayarlayın. Filtre. -20 ° C'de alikotları Mağaza
Paraformaldehyde% 4 / Asit asetik 5%			950 ul paraformaldhyde + 50 ul asetik asit
Pepsin	Sigma / Aldrich	P7000
Peroksidaz-konjuge anti-biotin	Calbiochem	203206
RBC yıkama ortamı: RPMI 1640 Glutamine çözümü	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 çözeltisi 5 ml glutamin
RBC yıkama ortamı: Gentamisin sülfat	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamisin sülfat
RNaz	Sigma / Aldrich		Bir 10 mg / ml stok çözeltisi edin.
RNaz ücretsiz 1.5 ml tüp	Ambion	AM12450
RNaz Zap	Ambion	AM9780
11mm 4 kuyu Slaytlar	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	3 M NaCl (175 g / l), 0,3 M Na sitrat, 3 x H2O (88 g / l), 1M HCI ile pH 7.0 'a ayarlayın
SSC 20x: Sodyum sitrat dihidrat	Sigma / aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g / l), 0,3 M Na sitrat, 3 x H2O (88 g / l), 1M HCI ile pH 7.0 'a ayarlayın
SSPE 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH 2 PO 4	Sigma / Aldrich	S0751	27.6 g NaH 2 PO 4.
SSPE 20x: 4 EDTA toz			9.4 g EDTA tozu DEPC su ekleyin, pH 7.4 ayarlayın. Oto20 dakika için Clave
TNB tampon: TNT tampon			10 ml tampon TNT
TNB tampon: Engelleme reaktifi			0.05g Engelleme reaktifi Bloke edici reaktif çözmek için, bir taraftan karıştırılarak bir saat süreyle 60 ° C ila çözelti ısıtın. -20 ° C'de saklayın (Perkin Elmer TSA-protokol türetilen.)
TNT tamponu: Tris / HCl	Sigma	T1503	1 M Tris / HCl, pH 8.0
TNT tamponu: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT tamponu: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl içeren 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Oda sıcaklığında, pH 7.5 'e ayarlayın. (Perkin Elmer TSA-protokol türetilen.)
TSA artı Cyanine3 / Floresein sistemi	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Deney başlamadan önce dikkatlice TSA Artı Flüoresans Palet Sistemi protokolü okuyun.
Steril tüpler 14 ml	Almeco - CM LAB Aps	91016