Análise de uma única célula de transcrição do gene pela RNA Fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridização (FISH)

Resumo

Fluorescente In situ Hibridização (FISH) para identificar transcritos de ARNm em células individuais permite a análise da actividade poligênica tais como a transcrição simultânea de mais do que um membro da Var Família multigênica em Plasmodium falciparum Eritrócitos infectados ¹. A técnica é adaptável e pode ser usado em diferentes tipos de genes, células e organismos.

Resumo

Adesão de eritrócitos infectados por Plasmodium falciparum (IE) para receptores endoteliais humanas durante infecções de malária é mediada pela expressão de PfEMP1 variantes proteicas codificadas pelos genes var.

O P. haplóide falciparum genoma alberga aproximadamente 60 diferentes genes var de que um só tenha sido acreditados para ser transcrito por célula de cada vez, durante o estágio de sangue da infecção. Como regra, tais mutuamente exclusivos da transcrição de genes var é alcançado não é clara, assim como a identificação de genes individuais var ou sub-grupos de genes var associados com diferentes receptores e da consequência da ligação diferencial sobre os resultados clínicos de P. falciparum. Recentemente, o paradigma transcrição mutuamente exclusivos tem sido posta em dúvida por ensaios de transcrição com base no P. indivíduo falciparum identificação transcrição em inf únicoected células eritrocitários usando RNA hibridização in situ fluorescente (FISH) de análise de transcrição do gene var pelo parasita em núcleos individuais de P. falciparum IE ^1.

A seguir, apresentamos um protocolo detalhado para a realização do método RNA-FISH para análise da transcrição de genes var em núcleos única de P. falciparum infectados eritrócitos humanos. O método baseia-se na utilização de digoxigenina e biotina marcado com sondas de RNA anti-sentido, utilizando o sistema de Fluorescência de TSA Além paleta ² (Perkin Elmer), as análises microscópicas e P. recém seleccionada falciparum IE. O método de hibridização in situ pode ser usado para controlar a transcrição e a regulação de uma variedade de genes expressos durante as diferentes fases do P. falciparum ciclo de vida e é adaptável a espécie de malária outros parasitas e outros organismos e tipos de células.

Protocolo

1. Geração de recentemente selecionados eritrócitos infectados

Para este ensaio, os melhores resultados são obtidos quando se utiliza as culturas de fresco seleccionados para a expressão de superfície da proteína PfEMP1. Nesta experiência particular, a P. 3D7 linhagem falciparum foi seleccionada utilizando anticorpos específicos como previamente descrito ^1.

Dia 1

1. Ul 200 de colheita de células do sangue compactados a partir de um p falciparum de cultura contendo IE fase final de 2-5% por centrifugação a 800 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente.
2. Re-suspender o sedimento de sangue em 2 ml de 37 ° C uma solução de 0,75% de gelatina quente em um tubo de 14 ml estéril, e deixar durante 15-20 min a 37 ° C para permitir que o IE não infectados e anel estágio para sedimentar.
3. Colheita do IE de fase final, isto é, a fase superior, para um tubo novo ml 14 e lavar duas vezes com 10 ml de 37 ° C, lavagem quente RBC-media.
4. Diluir 50 ul de anticorpos específicos anti-PfEMP1 anticorpos em 2 ml de 37 ° C quentes RBC-lavagem e meios filtrantes estéreis.
5. Misture o IE de fase final lavada com anti-soros diluídos esterilizada num tubo de 14 ml estéril e incubar durante 30 min a 37 ° C com agitação suave.
6. Girar a 800 xg durante 8 minutos à temperatura ambiente, e lava-se duas vezes com 10 ml de 37 ° C, lavagem quente RBC-media.
7. Lave 50 ul da Proteína Dynabead A suspensão por duas vezes com RBC-lavagem mídia usando um ímã-15 DynaMaq.
8. Ressuspender as Dynabeads em 300 uL RBC-lavagem de mídia e adicioná-los ao IE fase final de lavada. Incubar durante 30 min a 37 ° C com agitação suave.
9. Transferir o tubo para o íman DynaMaq-15. Deixe por 1-2 minutos e retirar todo o líquido.
10. Ressuspender as Dynabeads em 4-5 ml de RBC-lavagem de mídia. Transfira a volta tubo sobre o ímã e deixe por 1-2 minutos antes de retirar todo o líquido. Repetir o passo de lavagem uma vez.
11. Transferir as pérolas lavadas para um 25 cm f cultura ² estérillask contendo 200 ul de fresco glóbulos vermelhos. Adicionar 5-6 ml de Albumax mídia na cultura. Armazenar durante a noite a _5% de CO2 a 37 ° C.

Dia 2

12. Remover as Dynabeads da cultura quando o IE seleccionou reocuparam as novas células vermelhas do sangue através da transferência de toda a cultura para um tubo de 14 ml estéril. Coloque o tubo sobre o ímã-15 DynaMaq e deixe por 1-2 min. Em seguida, despejar todo o líquido de volta para um frasco de cultura.
13. Cultura para o maior número possível de ciclos até a parasitemia de 5-10% e parasitas estão no ringstage.
14. IE devem ser analisadas por FACS para se certificar de que o fenótipo de superfície correcta, ou seja, a expressão da proteína de um ou outro and/orPF11_0008 PFD1235w foi obtida ^1.

2. Preparação de Sondas

As sondas de RNA anti-sentido foram obtidas a partir das regiões mais variáveis ​​do PFD1235w e o var PF11_0008 </ Em> genes de P. falciparum 3D7 DNA genómico. O DNA foi amplificado por PCR e clonado no vector pSPT18 ou 19 para a transcrição, respectivamente de acordo com a descrição do fabricante (Roche). As sondas (580 pares de bases (pb) e 590 bp de comprimento) foram marcadas com digoxigenina (DIG) ou biotina utilizando um kit de marcação de ARN DIG ou a biotina RNA Mix rotulagem, respectivamente. Foi confirmada a especificidade das sondas tanto por análise de Northern blot e por um único rótulo análise FISH ^1.

3. Smear fina e Fixação de Parasitas Antes de Hibridização In Situ

Dia 1

Todos os passos são executados em um ambiente livre de RNase e todos os reagentes são RNase ou pré-tratadas com pirocarbonato de dietilo (DEPC) ou Zap RNase (Invitrogen). Os slides e lamínulas devem ser limpos com álcool para remover manchas de graxa fabricação residual. É importante realizar o protocolo, sem qualquer pausa entre os passosa fim de minimizar o risco de contaminação por nuclease.

1. Fazer uma película fina de sangue pelo método de difusão padrão ^3. Usando a lente 100x óleo objetivo do microscópio, contar o IE e calcular o percentual de IE na cultura. Verifique se os estágios do parasita estão em sincronia aproximada, no ringue e fases iniciais do ciclo de trofozoíto IE. Estes são pré-reprodução, uni-nucleadas fases, o mRNA do gene que expressa var e adequados para células individuais ensaios FISH transcrição deste tipo.
2. Transferir 50 uL da cultura parasita, a uma parasitemia de 5-10%, para um tubo Eppendorf de 1,5 ml sem RNase. Centrifugar durante 1 minuto a 2000 rpm à temperatura ambiente.
3. Remova a mídia e adicionar 50 pH PBS 7,2 em água tratada com DEPC. Agitar suavemente o tubo. Repetir o passo de sedimentação por centrifugação duas vezes para lavar as células livres a partir de meios de comunicação e os resíduos celulares.
4. Fazer quatro esfregaços finos de boa qualidade. Para cada esfregaço, fazer um esfregaço paraum diâmetro de 11 mm poço de uma corrediça 4 bem, ou seja, quatro lâminas de vidro, no total, em uma capa sem RNase (um passo crítico). Onda desliza brevemente ao ar para secar. Fazer três lâminas extra para slides negativo e um controlo para coloração única sonda para qualquer outro gene irrelevante usando uma sonda específica, uma outra corrediça para o tratamento com RNase e uma terceira lâmina contendo IE não expressa o gene de interesse. Deixe os slides para secar no banco por 10-20 min.
5. Fixar os filmes finos por adição de 60 ul de solução de fixação contendo paraformaldeído a 4% e 5% de ácido acético glacial para os poços. Deixe por 10 minutos no banco à temperatura ambiente.
6. Lavar as lâminas em 2x SSPE tampão durante 5 minutos por meio de agitação suave à temperatura ambiente. Resumidamente remover o excesso de líquido por tocar os poços que contêm as células suavemente com um lenço de papel.
7. Cobrir as lâminas com pepsina a 0,01% em HCl 0,01 M durante 2 min a 37 ° C (um passo extremamente crítico). Lavar as lâminas em 2x SSPE, durante 5 min à temperatura ambiente.
8. Dilui-se a solução de RNase para obter uma concentração final de 10 ug / ml. Cobrir os esfregaços de controlo negativo com 60 ul da solução de RNase. Incubar durante 30 min a 37 ° C e depois lavar as lâminas em 2x SSPE, durante 5 min à temperatura ambiente.
9. Prosseguir imediatamente para a etapa de hibridização.

4. A hibridação de sondas de RNA de lâminas fixas

Dia 1

1. Preparar a câmara de hibridação, tal como um ThermoStar 100 HC4 ou uma caixa vazia ponta da pipeta colocar num forno limpo, por pulverização com RNase Zap e limpando-a limpa com um lenço de papel. Encher os canais da câmara de hibridação ou o fundo da caixa com água tratada com DEPC para certificar-se de que as lâminas não sequem durante a hibridação. Fechar a câmara e pré-aquecimento a 48 ° C.
2. Diluir as sondas em solução de hibridização para uma concentração final de 12 ng / ul. Desnaturar a solução de sonda a 65 ° C durante 5 minutos num bloco de aquecimento. Imediatamente relaxar no gelo.
3. Resumidamente as lâminas de ar seco após a lavagem 2x SSPE. Cuidadosamente remover o excesso de líquido em torno dos poços com um lenço de papel.
4. Abrir a câmara de hibridação e colocar as lâminas na câmara. Aplicar uma ou ambas as sondas em um volume total de 60 ul por cavidade. Cuidadosamente cobrir a gota de líquido com uma lamela de cobertura isenta de RNase usando fórceps estéreis.
5. Fechar a câmara e hibridizar as lâminas a 48 ° C durante pelo menos 16 horas durante a noite.

5. Conjugação de anticorpos e de amplificação de fluorescência

Dia 2

Os passos que se seguem têm por base o TSA Plus Sistema Paleta de fluorescência a partir de Perkin Elmer. Todos os passos são realizados à temperatura ambiente.

1. Lavar as lâminas três vezes em tampão TNT durante 5 minutos com agitação suave.
2. Bloquear os poços em 150 ul de tampão de TNB para 30 min.
3. Dilui-se o anticorpo conjugado com HRP α DIG-TNB em tampão na proporção de 1:100 e o anticorpo conjugado com HRP α-biotina em tampão de TNB, na proporção de 1:500. Remover qualquer excesso de tampão TNB se as lâminas com um lenço de papel. Ao detectar duas transcrições simultaneamente, ambos os anticorpos podem ir de uma vez. Aplicar uma quantidade total de 100 ul da solução de anticorpo-TNB por poço e cuidadosamente cobrir com uma lamela. Incubar as lâminas durante 2 horas.
4. Retire as lamínulas cuidadosamente. Lavar as lâminas em tampão TNT 3 vezes durante 5 min.
5. Dilui-se o fluoróforo FITC no reagente de amplificação tiramida em uma proporção de 1:500 e utilizar a 100 ul da solução em cada poço. Cobrir os poços com lamelas e incubar durante 12 min.
6. Remover a tampa desliza cuidadosamente e lavar as lâminas três vezes durante 5 min em tampão TNT, por agitação suave.
7. Dilui-se a Cyan3 fluoróforo no reagente de amplificação tiramida a uma razão de 1:500. Adicionam-se 100 ul porbem desta solução. Cobrir os poços com lamelas e incubar durante 12 min.
8. Remova a tampa desliza cuidadosamente e depois enxaguar as lâminas rapidamente por imersão em tampão TNT.
9. Lavar as lâminas três vezes com tampão TNT, durante 5 min.
10. Imergir os slides rapidamente em água tratada com DEPC.
11. Deixe as lâminas para o ar seco. Montar as lâminas com anti-fade reagente contendo DAPI. Selar os cantos das lamínulas com unha polonês.
12. Os slides estão prontos para microscopia. Manter as lâminas cobertas com folha de alumínio e armazenar a 4 ° C se a experiência é para ser completada no dia seguinte. A vedação completa dos lados das lâminas pode ser realizada 24 horas após a aplicação do reagente anti-desbotamento. Isto irá permitir que as lâminas a ser trabalhada por até uma semana após o protocolo ter sido completado.

6. A visualização das sondas hibridizadas

1. Ligue o microscópio. Um microscópio de imunofluorescência padrão é suffictário para esse tipo de experiência, mas se você tiver acesso a um microscópio confocal você também pode usar isso para imagens 3D ou obter vídeos de suas células coradas. Permitir microscópio para aquecer por 15-30 min. Ligue o computador eo software.
2. Verificar a qualidade da coloração no microscópio de imunofluorescência. Escolha um local que contém alguns parasitas.
3. Ajustar o ganho de cada laser manualmente. Ajuste o pixel habitam a 4-6 m ^-1 s ^-1 e os passos para 512 x 512 pixels.
4. Tire uma foto de teste usando Frame Lambda. Reajustar o ganho do laser.
5. Ter um mínimo de 20 fotos boas de fluorescentes células individuais. Pelo menos 2-5 imagens de um campo que contém 5-20 parasitas são necessários a fim de obter uma visão apropriada a percentagem de parasitas positivos.

Resultados

A Figura 1 ilustra um fluxograma dos passos principais e do tempo de duração da metodologia FISH RNA.

Uma série de imagens representativas de bem e mal conservadas experiências FISH manchadas de mRNA utilizando P. única falciparum IE são mostrados na Figura 2. Este protozoário intracelular tem um núcleo (1-1,5 um de diâmetro) de pequeno porte, que é tingido de azul com DAPI. Vinte e quatro horas após a invasão dos eritrócitos e...

Discussão

RNA análise FISH, em contraste com os métodos tais como a Northern blotting e RT-PCR, permite a discriminação de transcritos de mRNA específicos ao nível da célula individual. Isto torna possível a discriminação entre as células transcricionalmente activos e inactivos, neste exemplo, P. falciparum protozoários parasitas dentro glóbulos vermelhos humanos. Tais células inteiras observações são muitas vezes necessário e pode desvendar importantes e romance padrões de transcrição ^1. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Ácido acético	Sigma / Aldrich	338.826-100ml
Albumax mídia: solução RPMI Glutamina 1640	Lonza	BE12-115F	500 ml de RPMI 1640 Solução de 5 ml de glutamina
Albumax mídia: Gentamicina sulfato Albumax solução	Lonza	BE02-012E	2,5 ml de gentamicina sulfato 50 ml solução Albumax-
Albumax solução: Hipoxantina	Sigma-Aldrich	H9377	0,8 g Hipoxantina
Albumax solução: AlbuMAX II	Eunvitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax solução: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 litros RPMI 1640 Dissolver com ímã no máximo. 50 ° C. Filtrar esterilizar e armazenar a -20 ° C em alíquotas.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Resina para deionize formamida.
Anti-biotina de cabra conjugado com peroxidase de pAb	Calbiochem	203206
Anti-Dig anticorpo	Novus biológicos	NB100-41330
Anti-fade reagente com DAPI	Invitrogen	P36931	Os meios de montagem tem a curar durante 24 h antes de selar completamente a lâmina.
Biotina RNA Labeling Mix	Roche	11685597910
Câmera digital	Nikon vista digital DC-F11
Lamelas	Menzel-glaser	631-1570
cultura em balão de 25 centímetros de superfície 2 Nunclon	Nunc	156340
DEPC	Fluka / Sigma	32.490-100ml	1 ml DEPC em 1000 ml de água deionizada. Adicionar uma barra de agitação e agita-se durante 12 h. Autoclave durante 30 minutos.
Câmera digital	Nikon vista digital DC-F11
Dynabeads Proteína A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Ímã	Invitrogen	123-01D
Formamida 99% bioultra	Fluka/ Sigma	47671-1l-F	Formamida desionizada: 5 g de resina de permuta iónica, por 100 ml de formamida. Agita-se 30 min. Filtrar através de papel Whatman.
Gelatina solução a 0 75%:. Gelatina	Sigma-Aldrich	G2500	3,75 g de gelatina em 500 ml de RPMI 1640. Aquece-se a 56 ° C para dissolver. Filtrar esterilizar quando 56 ° C. Armazenar a -20 ° C em alíquotas.
Gelatina solução a 0 75%:. RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3,75 g de gelatina em 500 ml de RPMI 1640. Aquece-se a 56 ° C para dissolver. Filtrar esterilizar quando 56 ° C. Armazenar a -20 ° C em alíquotas.
Solução de glutamina: L-glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	14,6 g de glutamina L em 500 ml de NaCl a 0,9%. Dissolver, filtro sterilize e armazenar a -20 ° C em alíquotas.
Solução de glutamina: HCl	Sigma	H1758	14,6 g de glutamina L em 500 ml de NaCl a 0,9%. Dissolver, filtrar esterilizar e armazenar a -20 ° C em alíquotas.
Solução de hibridação: Formamida 99% Bio ultra-SSC 20x	Fluka / Sigma	47671-1l-F	20 ml Total, manter congelados a -20 ° C em alíquotas 10 ml de formamida desionizada
Solução de hibridação: concentrado 50x Denhardt	Sigma	D2532	20xSSC 5ml
Solução de hibridação: Yeast tRNARoche reagente de bloqueio	Sigma	R-6750	2 ml de 50x Denhardt 250 mg 20 ul por ml de ARNt de levedura
Solução de Hibridação: DNA de esperma de salmão	Fluka / Sigma	31.149-106GF	0,4 g Roche bloqueio reagente 1 ml de 10 mg por ml de DNA de esperma de salmão (Crítica: desnaturar spermDNA salmão a 96 ° C durante 5 min antes da adição à solução de hibridação)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Pode ser substituído por forno de hibridação e câmaras de hibridização RNAse preenchidos com água DEPC.
Imersão em óleo UV transparente fluorescência livre	Sigma	10.976-1EA
Microscópio de imunofluorescência ou confocal	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	Disponível em qualquer farmácia
PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 2H 2 O x KH 2 PO 4 DEPC H2O deionizada			Ajust pH para 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldeído a 4%	Fluka / Chemika	76240	4 g PFA em 80 ml de PBS / DEPC. Aquece-se a 65 ° C até que o PFA dissolve. Adicionar 20 ml de PBS, permitir que a solução arrefeça. Ajustar o pH a 7,4. Filtrar. Armazenar em alíquotas a -20 ° C.
Paraformaldeído a 4% / ácido acético a 5%			950 paraformaldhyde ul + 50 ul de ácido acético
Pepsina	Sigma / Aldrich	P7000
Conjugado com peroxidase anti-biotina	Calbiochem	203206
RBC-lavagem de mídia: solução RPMI Glutamina 1640	Lonza	BE12-115F	500 ml de RPMI 1640 5 ml solução glutamina
RBC-lavagem de mídia: sulfato de gentamicina	Lonza	BE02-012E	2,5 ml de gentamicina sulfato
RNase	Sigma / Aldrich		Faça um de 10 mg / ml de solução.
RNase livre tubo 1,5 ml	Ambion	AM12450
RNase Zap	Ambion	AM9780
Desliza 4 poços 11 milímetros	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	NaCl 3 M (175 g / l), 0,3 M de citrato de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajustar o pH a 7,0 com HCl 1M
SSC 20x: citrato de sódio desidratado	Sigma / Aldrich	W302600	NaCl 3 M (175 g / l), 0,3 M de citrato de Na 3 x H 2 O (88 g / l) Ajustar o pH a 7,0 com HCl 1M
SSPE 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	175,3 g de NaCl
SSPE 20x: NaH 2 PO 4	Sigma / Aldrich	S0751	27,6 g NaH 2 PO 4.
SSPE 20x: 4 EDTA pó			9,4 g de EDTA em pó Adicione a água DEPC, ajustar o pH 7,4. Automáticoclave durante 20 min
TNB tampão: tampão TNT			10 ml de tampão TNT
TNB buffer: reagente de bloqueio			Reagente de bloqueio 0,05 g Para dissolver o reagente de bloqueio, aquecer a solução a 60 ° C durante uma hora com agitação. Armazenar a -20 ° C. (Derivado da Perkin Elmer TSA-protocolo).
TNT buffer: Tris / HCl	Sigma	T1503	1M Tris / HCl, pH 8,0
Tampão TNT: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT buffer: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O869 Ml Ajustar o pH para 7,5 à temperatura ambiente. (Derivado da Perkin Elmer TSA-protocolo).
TSA mais o sistema Cyanine3 / Fluoresceína	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Leia o protocolo da TSA Plus Sistema Paleta de fluorescência cuidadosamente antes de iniciar o experimento.
Tubos de 14 ml estéril	Almeco - CM LAB Aps	91016