Анализ одноклеточных транскрипции гена РНК-флуоресцентный<em&gt; В Situ</em&gt; Гибридизация (FISH)

Резюме

Флуоресцентный На месте Гибридизации (FISH) для выявления транскриптов мРНК в отдельных клетках позволяет провести анализ полигенных деятельности, такие как одновременное транскрипции более чем одного члена Var Мультигенного семьи в Plasmodium тропической Инфицированных эритроцитов ¹. Этот метод является гибкой и может быть использована на различные типы генов, клеток и организмов.

Аннотация

Адгезия Plasmodium тропической инфицированных эритроцитов (IE) в человеческих эндотелиальных рецепторов во время заражения малярией при посредничестве выражения PfEMP1 вариантов белка, кодируемого VAR генов.

Гаплоидный P. тропической таит в геноме около 60 различных вар генов, из которых только один был Считается, что транскрибируется в камере в то время, в течение кровью стадии инфекции. Как такие взаимоисключающие регулирования VAR транскрипции генов достигается неясно, как это идентификация отдельных генов или VAR подгруппы VAR генов, связанных с различными рецепторами и следствие дифференциальной обязательными для клинического исхода П. тропической инфекции. В последнее время взаимоисключающие парадигмы транскрипции была поставлена ​​под сомнение транскрипции анализы, основанные на отдельных P. тропической стенограммы идентификации в разовыхected эритроцитарных клеток с помощью РНК-флуоресцентной гибридизации (FISH) анализ VAR транскрипции генов паразита в отдельных ядер P. тропической IE ^1.

Здесь мы представляем подробный протокол для проведения РНК-FISH методологии анализа VAR транскрипции генов в одно-ядрах P. тропической инфицированных эритроцитов человека. Метод основан на использовании дигоксигенином и биотин-меченых зондов антисмысловой РНК помощью TSA Plus флуоресценции Палитра Система ² (Perkin Elmer), микроскопические анализы и недавно выбранный P. тропической IE. На месте методом гибридизации может быть использован для контроля транскрипции и регулирования различных генов, выраженных в ходе различных этапов P. тропической жизненного цикла и может быть адаптирована к другим малярийных паразитов рыб и других организмов и типов клеток.

протокол

1. Генерация Свежий Выбранный зараженных эритроцитов

Для этого теста, лучшие результаты получаются при использовании культур недавно выбранных для поверхностного выражения PfEMP1 белка. В данном эксперименте 3d7 P. тропической линии был выбран с помощью специфических антител, как описано ранее ^1.

День 1

1. Урожай 200 мкл упакованных клеток крови из P. тропической культуры, содержащие 2-5% в конце IE этапе путем центрифугирования при 800 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре.
2. Повторное приостановить кровь гранул в 2 мл 37 ° C теплый 0,75% раствор желатина в 14 мл стерильной пробирке, и оставить на 15-20 мин при 37 ° C, чтобы неинфицированных и кольцо стадии IE в осадок.
3. Урожай поздних стадиях IE, то есть верхнюю фазу, в новый 14 мл трубки и мыть два раза по 10 мл 37 ° C теплый РБК-стирка СМИ.
4. Развести 50 мкл специфических анти-PfEMP1 антител в 2 мл 37 ° С теплыми РБК-стирка средствами массовой информации и стерильный фильтр.
5. Смешать промытый поздней стадии IE с стерилизованное разбавленный антисыворотки в 14 мл стерильной пробирке и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C при осторожном перемешивании.
6. Спином вниз на 800 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре, и мыть два раза по 10 мл 37 ° C теплый РБК-стирка СМИ.
7. Вымойте 50 мкл Dynabead белка подвеска дважды РБК-стирка массовой информации, использующих DynaMaq-15 магнита.
8. Ресуспендируют Dynabeads в 300 мкл РБК-стирка СМИ и добавить их в промытую поздней стадии IE. Инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C при осторожном перемешивании.
9. Передайте трубку к DynaMaq-15 магнита. Оставьте на 1-2 минут и удалить все жидкости.
10. Ресуспендируют Dynabeads в 4-5 мл РБК-стирка СМИ. Передайте трубку обратно на магните и оставьте на 1-2 минут, прежде чем снимать всю жидкость. Повторите стадии промывки один раз.
11. Передача промытый бусины на 25 см ² стерильных F культурыласк, содержащие 200 мкл свежей эритроцитарной массы. Добавить 5-6 мл Albumax средств массовой информации в культуре. Хранить в течение ночи при 5% CO ₂ при 37 ° C.

День 2

12. Снимите Dynabeads от культуры, когда выбран ИЭ reinvaded свежие эритроциты, передав все культуры в 14 мл стерильной пробирке. Положите трубку на DynaMaq-15 магнита и оставить на 1-2 мин. Затем залить все жидкости обратно в колбу культуры.
13. Культура как для нескольких циклов насколько возможно, пока паразитемии 5-10% и паразиты находятся в ringstage.
14. IE должны быть проанализированы FACS, чтобы убедиться, что правильный фенотип поверхности, т.е. экспрессия белка либо and/orPF11_0008 PFD1235w был получен ^1.

2. Подготовка зонды

Антисмысловую РНК-зондов были получены из самых разнообразных регионов PFD1235w и PF11_0008 VAR </ EM> генов из P. тропической 3d7 геномной ДНК. ДНК амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в pSPT18 или 19 вектор для транскрипции, соответственно, по описанию производителя (Roche). Зондов (580 пар оснований (п.о.) и 590 б.п. в длину) были помечены дигоксигенин (DIG) или биотин помощью DIG РНК маркировки Kit или биотин РНК маркировки Mix, соответственно. Мы подтвердили специфичность проб и анализов на Северном пятно и одной меткой FISH анализа ^1.

3. Тонкий мазок и фиксации Паразиты До в гибридизация

День 1

Все действия выполняются в РНКазы окружающей среды и все реагенты РНКазы или предварительно обрабатывают диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) или РНКазы Зап (Invitrogen). Слайдов и покровные стекла должны быть очищены спиртом для удаления остатков смазки производства. Важно, чтобы выполнить протокол без паузы между шагамиВ целях сведения к минимуму риска загрязнения нуклеазы.

1. Сделать тонкой пленкой крови стандартным методом распространения ^3. Использование 100x объектива нефти микроскопом, подсчитать IE и расчета доли IE в культуре. Проверьте, что паразит этапов в приближенных синхронно, в кольце и в начале Трофозоита этапах IE цикла. Таковы предварительные репликации, одно-пузырькового стадии, выражая VAR мРНК гена и подходит для одной ячейки FISH транскрипции анализа этого типа.
2. Передача 50 мкл культуры паразита, на паразитемии на 5-10%, до 1,5 мл РНКазы трубки Эппендорф. Центрифуга течение 1 мин при 2000 оборотов в минуту при комнатной температуре.
3. Удалить СМИ и добавить 50 мкл PBS рН 7,2 в DEPC обработанной воды. Перемешивать трубку осторожно. Повторите шаг центробежного осаждения в два раза мыть клетки свободны от средств массовой информации и остатков клеток.
4. Сделайте четыре хорошего качества тонких мазков. Для каждого мазка, сделайте один мазок наодин 11 мм в диаметре скважины 4 хорошо слайд, то есть четыре стеклянные слайды в общем, в РНКазы капот (критический шаг). Волна скользит кратко в воздух, чтобы высохнуть. Сделайте три дополнительные слайды для отрицательного контроля одного слайда для одного окрашивания зонд для любой другой ген имеет значения с использованием специального зонда, другой слайд для РНКазы лечение и третий слайд, содержащий IE не выражал интерес гена. Оставьте слайды для просушки на скамейке в течение 10-20 мин.
5. Исправить тонких пленок путем добавления 60 мкл фиксации раствор, содержащий 4% параформальдегида и 5% ледяной уксусной кислоты в скважинах. Оставьте на 10 минут на скамейке при комнатной температуре.
6. Вымойте слайды в 2x ГНПП буфера в течение 5 минут на легком перемешивании при комнатной температуре. Коротко удаления избытка жидкости, касаясь лунки, содержащие клетки осторожно салфеткой.
7. Накройте слайды с 0,01% пепсина в 0,01 М HCl в течение 2 мин при 37 ° C (чрезвычайно важный шаг). Вымойте слайды в 2x ГНПП течение 5 мин при комнатной температуре.
8. Разведите раствор РНКазы до конечной концентрации 10 мкг / мл. Накройте отрицательных мазков управления с 60 мкл раствора РНКазы. Инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C, а затем вымыть слайды в 2x ГНПП течение 5 мин при комнатной температуре.
9. Немедленно приступить к гибридизации шаг.

4. Гибридизация РНК-зондов для фиксированного Слайды

День 1

1. Подготовка гибридизации камеры, такие как Thermostar 100 HC4 или пустую коробку кончика пипетки помещают в чистую печь, путем распыления с РНКазы Зап и вытирая его в чистоте с бумажной ткани. Заполните каналы камеры гибридизации или в нижней части коробки с DEPC обработанной воды, чтобы убедиться, что слайды не будут высыхать при гибридизации. Закройте камеру и разогрейте до 48 ° C.
2. Развести зонды в гибридизации решение конечной концентрации 12 нг / мкл. Денатурации зонд раствора при 65 ° C в течение 5 мин в нагревательный блок. Немедленно охладить на льду.
3. Коротко сухой воздух слайды после стирки 2x ГНПП. Аккуратно удалите лишнюю жидкость вокруг скважины с бумагой.
4. Откройте гибридизации камеру и поместить слайды в камере. Применение одного или обоих зондов в общем объеме 60 мкл на лунку. Осторожно покрытия капли жидкости с РНКазы покровного стекла с использованием стерильных щипцов.
5. Закройте камеру и гибридизуется слайды при 48 ° C в течение не менее 16 часов в течение ночи.

5. Сопряжение антител и флуоресцентного усиление

День 2

Следующие шаги основаны на TSA Plus флуоресценции Палитра системы от Perkin Elmer. Все действия выполняются при комнатной температуре.

1. Вымойте слайды 3 раза в буфере TNT в течение 5 мин при осторожном перемешивании.
2. Блок скважины в 150 мкл буфера TNB в течение 30 мин.
3. Развести HRP-конъюгированных α-DIG антител в буфере TNB в соотношении 1:100 и HRP-конъюгированных α-биотина антител в буфере ТНБ, в соотношении 1:500. Удалите излишки буфера TNB из слайдов с бумагой. При обнаружении двух транскриптов одновременно, как антитела могут идти одновременно. Нанесите на общую сумму в 100 мкл антитела TNB раствора на хорошо и тщательно накрыть крышкой скольжения. Инкубируйте слайды в течение 2 часов.
4. Снимите крышку скользит внимательно. Вымойте слайды в буфере TNT 3 раза в течение 5 мин.
5. Развести FITC-флуорофора в tyramide реагента усиления в соотношении 1:500 и применять по 100 мкл раствора в каждую лунку. Накройте крышкой скважин с промахами и инкубировать в течение 12 мин.
6. Снимите крышку скользит тщательно вымыть и слайды 3 раза в течение 5 мин в буфере TNT нежным агитации.
7. Развести Cyan3-флуорофора в tyramide реагента усиления в соотношении 1:500. Добавить 100 мкл наа этого решения. Накройте крышкой скважин с промахами и инкубировать в течение 12 мин.
8. Снимите крышку скользит внимательно, а затем промыть слайды быстро путем погружения в буфере TNT.
9. Вымойте слайды 3 раза TNT буфера в течение 5 мин.
10. Погрузитесь слайды быстро DEPC обработанной воды.
11. Оставьте слайды высохнуть на воздухе. Установите слайды с анти-Fade реагентом, содержащим DAPI. Печать по углам крышки скользит с лаком для ногтей.
12. Слайды готовы для микроскопии. Держите горки покрыты алюминиевой фольгой и хранить при 4 ° C, если эксперимент будет завершен на следующий день. Полная герметизация стороны слайдов может быть осуществлена ​​через 24 часа после применения анти-Fade реагента. Это позволит слайдов, чтобы быть отображена на срок до одной недели после того, как протокол был завершен.

6. Визуализация гибридизированных зонды

1. Включите микроскопом. Стандартные иммунофлюоресценции микроскоп sufficдиентом для такого эксперимента, но если у вас есть доступ к конфокальной микроскопии Вы также можете использовать это для 3D-изображений или для получения видео из ваших окрашенных клеток. Разрешить микроскоп, чтобы прогреться в течение 15-30 мин. Включите компьютер и программное обеспечение.
2. Проверьте качество окраски на иммунофлюоресценции микроскопом. Выберите место, содержащий несколько паразитов.
3. Регулировка усиления каждого лазерного вручную. Отрегулируйте пикселей жить до 4-6 м ^-1 с ^-1 и шаги, до 512 х 512 пикселей.
4. Пройти тест изображения с помощью кадров Lambda. Отрегулируйте усиления лазера.
5. Возьмите как минимум 20 хороших фотографий люминесцентных отдельных клеток. По крайней мере, 2-5 фотографий поле, содержащее 5-20 паразитов необходимы для того, чтобы получить справедливую обзор процент положительных паразитов.

Результаты

На рисунке 1 показана блок-схема основных этапов и длительности методологии FISH РНК.

Серия представитель изображениями хорошо, и плохо сохранившиеся окрашенных экспериментов FISH мРНК с использованием одной P. тропической IE показано на рисунке 2. Это...

Обсуждение

РНК FISH анализ, в отличие от методов, таких как Северная блоттинга и RT-PCR, позволяющий дискриминации конкретных транскриптов мРНК на одном уровне клетки. Это позволяет различать транскрипционно активные и неактивные клетки, в данном примере, P. тропической паразитических простейших...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Уксусной кислоты	Sigma / Aldrich	338 826-100мл
Albumax СМИ: RPMI 1640 Глютамин решения	Lonza	BE12-115F	500 мл RPMI 1640 5 мл глутамина решения
Albumax СМИ: гентамицина сульфат Albumax-решения	Lonza	BE02-012E	2,5 мл гентамицина сульфат 50 мл раствора Albumax
Albumax-решения: гипоксантин	Sigma-Aldrich	H9377	0,8 г гипоксантин
Albumax-решения: AlbuMAX II	Яnvitrogen	11021-037	200 г Albumax
Albumax-решения: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4-литровый RPMI 1640 Растворите с магнитом на макс. 50 ° C. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре -20 ° C в аликвоты.
Amberlite	Сигма	A5710-110G	Смола для deionize формамида.
Anti-биотин козы PAB пероксидазой	Calbiochem	203206
Anti-Dig антител	Novus биологические	NB100-41330
Anti-реагента с исчезают DAPI	Invitrogen	P36931	Монтаж средств массовой информации имеет вылечить в течение 24 ч до герметизации слайд полностью.
Биотин РНК маркировки Mix	Roche	11685597910
Камера цифровая	Nikon цифровых взгляд DC-F11
Покровные	Менцель-Glaser	631-1570
культуры колбы 25 см 2 поверхности Nunclon	Nunc	156340
DEPC	Fluka / Sigma	32 490-100мл	1 мл DEPC в 1000 мл deinonized воды. Добавить мешалку и перемешивают в течение 12 часов. Автоклаве в течение 30 мин.
Цифровой фотоаппарат	Nikon цифровых взгляд DC-F11
Dynabeads белка	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Магнит	Invitrogen	123-01D
Формамид bioultra 99%	Fluka/ Sigma	47671-1L-F	Деионизированная формамида: 5 г ионообменных смол на 100 мл формамида. Размешайте 30 мин. Фильтр по ватмана.
. Желатин 0 75% раствор: Желатин	Sigma-Aldrich	G2500	3,75 г желатина в 500 мл RPMI 1640. Нагреть до 56 ° C до растворения. Фильтр стерилизовать при 56 ° C. Хранить при -20 ° C в аликвоты.
. Желатин 0 75% раствор: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3,75 г желатина в 500 мл RPMI 1640. Нагреть до 56 ° C до растворения. Фильтр стерилизовать при 56 ° C. Хранить при -20 ° C в аликвоты.
Глютамин решение: L-глутамина	Sigma-Aldrich	G3126	14,6 г L глутамина в 500 мл 0,9% NaCl. Растворить, фильтр сterilize и хранить при температуре -20 ° C в аликвоты.
Глютамин решение: HCl	Сигма	H1758	14,6 г L глутамина в 500 мл 0,9% NaCl. Растворить, фильтр стерилизовать и хранить при температуре -20 ° C в аликвоты.
Гибридизация решение: Формамид Bio ультра 99% SSC 20x	Fluka / Sigma	47671-1L-F	Всего 20 мл, держать замораживали при -20 ° C в аликвотах 10 мл деионизированной формамида
Гибридизация решение: 50x концентрат Денхардта	Сигма	D2532	5 мл 20xSSC
Гибридизация решение: Дрожжи tRNARoche блокирующий реагент	Сигма	R-6750	2 мл 50х Денхардта 250 мкл 20 мг на мл дрожжевой тРНК
Гибридизация решение: ДНК спермы лосося	Fluka / Sigma	Тридцать одна тысяча сто сорок девять-106GF	0,4 г Roche блокирующий реагент 1 мл 10 мг на мл ДНК спермы лосося (Critical: денатурация лосося spermDNA при 96 ° С в течение 5 мин перед добавлением в раствор для гибридизации)
Hybridizer Thermostar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Может быть заменен печи гибридизации и РНКазы бесплатно камер гибридизации дополняется DEPC воды.
Погружение масла УФ-прозрачным флуоресценции бесплатно	Сигма	10976-1шт
Иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	Доступна в любой аптеке
PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 х 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC деионизованной H 2 O			Изправлена ​​рН до 7,4 160 г 4 г 23 г 4 г 1 л
Параформальдегид 4%	Fluka / chemika	76240	4 г PFA в 80 мл PBS / DEPC. Нагреть до 65 ° C до PFA растворяется. Добавить 20 мл PBS, дайте раствору остыть. Отрегулируйте рН до 7,4. Фильтр. Хранить в аликвоты при -20 ° C.
Параформальдегид 4% / Кислота уксусная 5%			950 мкл paraformaldhyde + 50 мкл уксусной кислоты
Пепсин	Sigma / Aldrich	P7000
Пероксидаза-сопряженных анти-биотин	Calbiochem	203206
РБК-стирка СМИ: RPMI 1640 Глютамин решения	Lonza	BE12-115F	500 мл RPMI 1640, 5 мл глутамина решения
РБК-стирка СМИ: гентамицина сульфат	Lonza	BE02-012E	2,5 мл гентамицина сульфат
РНКазы	Sigma / Aldrich		Сделайте 10 мг / мл маточного раствора.
РНКазы бесплатно 1,5 мл трубки	Ambion	AM12450
РНКазы Зап	Ambion	AM9780
Слайды 4 скважины 11мм	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	3 М NaCl (175 г / л) 0,3 М Na 3 цитрата х H 2 O (88 г / л) Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью 1М HCl
SSC 20x: дигидрат цитрат натрия	Sigma / Aldrich	W302600	3 М NaCl (175 г / л) 0,3 М Na 3 цитрата х H 2 O (88 г / л) Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью 1М HCl
ГНПП 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	175,3 г NaCl
ГНПП 20x: NaH 2 PO 4	Sigma / Aldrich	S0751	27,6 г NaH 2 PO 4.
ГНПП 20x: 4 EDTA порошок			9,4 г порошка ЭДТА Добавить DEPC воды, отрегулировать рН 7,4. Автоматическийнаколол в течение 20 мин
TNB буфера: TNT буфер			10 мл TNT буфер
TNB буфера: блокирующий реагент			0,05 г блокирующий реагент Для растворения блокирующий реагент, нагрейте раствор до 60 ° C в течение одного часа при перемешивании. Хранить при -20 ° C. (Производное от Perkin Elmer TSA-протокол).
TNT буфера: Tris / HCl	Сигма	T1503	1М Tris / HCl, рН 8,0
TNT буфера: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 мл
TNT буфера: Tween20	Сигма	93773	5 М NaCl 30 мл 1 мл DEPC дН 2 O869 Ml Отрегулируйте рН до 7,5 при комнатной температуре. (Производное от Perkin Elmer TSA-протокол).
TSA плюс Cyanine3 / Fluorescein системы	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Читайте протокол от TSA Plus флуоресценции Палитра системы, прежде чем начать эксперимент.
Трубы 14 мл стерильной	Almeco - CM LAB Aps	91016