使用电化学传感器的细菌检测和鉴定

摘要

我们描述了一种电化学传感器的测定方法，细菌的快速检测和识别。的测定法涉及官能化的传感器阵列与DNA的核糖体RNA（rRNA基因）的种属特异性序列的寡核苷酸捕捉探针。目标rRNA基因的捕获探针和辣根过氧化物酶相连的DNA寡核苷酸检测探针的夹心杂交产生可测量的安培电流。

摘要

电化学传感器被广泛用于快速，准确地测量血糖，并能适用于各种各样的分析物的检测。电化学传感器操作成一个有用的电信号传导生物识别事件。信号转导的发生了耦合到安培的电极的氧化还原酶的活性。传感器的特异性，使用固有特性的酶，葡萄糖氧化酶的葡萄糖传感器的情况下，或的酶和抗体，该抗体或探针之间的关系的商品。

在这里，我们描述的电化学传感器检测方法直接探测和识别细菌。在每一种情况下，这里所描述的探针DNA的寡核苷酸。此方法是基于夹心杂交的捕获和检测探针与目标的核糖体RNA（rRNA基因）。捕获探针被固定到所述传感器表面，而检测器的探头与步骤horseradish过氧化物酶（HRP）。当基片，例如3,3'，5,5' - 四甲基联苯胺（TMB）被添加到绑定到其表面上的复合物与捕捉目标检测器的电极被氧化，在基板由HRP减少工作电极。此氧化还原循环的结果是穿梭的电子从电极到辣根过氧化物酶的底物，生产电极中电流的流动。

引言

使用rRNA基因作为目标分子的细菌检测和鉴定了许多优点。 rRNA基因在细菌细胞中的丰度低至每毫升250个细菌提供了一个灵敏度极限，而不需要对目标扩增^1。包含独特的物种特异性细菌rRNA基因序列与DNA探针杂交。因此，电化学传感器的阵列可用于识别未知的细菌，其中每个传感器与不同的种属特异性捕获探针官能。应积极控制传感器包括合成的寡核苷酸的目标，"小桥流水"的捕获和检测探针，建立内部校准信号。

电化学传感器有着广泛的基础和转化研究中的应用。例如，这里所描述的测定法被用于精确测量大肠杆菌的效果大肠杆菌生长阶段RRNA和预rRNA基因的拷贝数，这是极大的兴趣，感兴趣的研究人员在细菌生理学^2。电化学传感器测定的灵敏度确定的信号噪声比。已探索各种信号放大和降噪方法。我们发现，改善传感器的表面的化学性质，以减少检测器的探头和/或HRP酶的非特异性结合是关键的。混合单层的alkanedithiols mercaptohexanol特别是，已经发现，以减少背景更完全地覆盖在电极表面，同时保持可访问性的捕获探针的目标杂交^3。在这些表面化学处理涉及复杂生物样品的分析是特别重要的。

研究方案

1。电化学传感器的官能

1. 制备巯基化的捕获探针的浓度为0.05μM，300μM1,6 - 己二硫醇（HDT）的10mM的Tris-HCl，1mM EDTA和在黑暗中孵育10分钟，在室温下，pH值8.0，0.3M NaCl的。孵化的巯基化的捕获探针与HDT确保捕获探针的硫醇基团上的减少，导致更一致的结果。
2. 氮气流中应用裸金16的传感器阵列芯片（s），持续5秒，以除去水分和/或颗粒物。
3. 6微升的HDT-巯基化的捕获探针混合物应用到所有的16个传感器的传感器阵列的工作电极，并在有盖培养皿中存储的传感器芯片（次），在4℃下过夜。巯捕获探针直接绑定到裸金电极和HDT起到防止装填过量的捕获探针，并让他们在一个伸展的构象，促进杂交与目标。
4. 该第二天，洗涤的去离子H ₂ O的传感器芯片，具有2〜3秒，干燥氮气流中下持续5秒。
5. 适用于6微升的10mM的Tris-HCl，1mM EDTA的0.3M NaCl的pH值为8.0，1 mM的6 - 巯基-1 - 己醇（MCH），所有的16个传感器，并孵育50分钟的工作电极。这和所有随后的传感器芯片孵育在有盖的培养皿中，在室温下进行。 MCH作为封端剂，巯基化的捕获探针或热变形温度是在电极表面上不存在的任何间隙填充。

2。样品制备

1. 吸取1毫升细菌培养的数生长期（OD _600≈0.1）离心管和离心16,000 XG 5分钟。取出培养物上清液。将细菌沉淀可立即处理，或储存于-80℃供以后使用。
2. 彻底将细菌沉淀重新悬浮于10μl的1 M NaOH中，通过将移液管尖的机器人TOM离心管吹打向上和向下几次。悬浮液在室温下孵育5分钟。
3. 中和细菌裂解液加入50μl的1M磷酸缓冲液，pH值7.2，含2.5％牛血清白蛋白（BSA）和0.25 mM的荧光素改性的探针检测器。孵育10分钟，在室温下中和裂解液。荧光改性探测器探针杂交细菌rRNA的目标分子。

3。电化学传感器检测

1. 从所述传感器芯片与去离子H ₂ O洗涤的MCH为2-3秒，干燥氮气流中下，持续5秒。
2. 适用于中和细菌裂解液4微升各14个传感器的工作电极上，并孵育15分钟。目标检测探针复合杂交巯基化捕获探针固定。
3. 应用4微升1纳米桥寡核苷酸在1M磷酸缓冲液，pH值7.2，含2.5％BSA和0.25＆亩，M荧光改性探测器探头2阳性控制传感器（用于信号正常化）和孵育15分钟。
4. 在2-3秒，干燥洗净的传感器芯片与去离子H ₂ O下氮气流中，持续5秒。
5. 应用在1M磷酸盐缓冲液，pH 7.2，含有0.5％酪蛋白的所有的16个传感器的工作电极上的4微升0.5 U / ml的抗荧光素-HRP孵育15分钟。的抗荧光素-HRP结合到固定化的荧光素改性探测器探头。
6. 在2-3秒，干燥洗净的传感器芯片与去离子H ₂ O下氮气流中，持续5秒。
7. 以及应用的膜，贴纸的表面进入传感器芯片安装在传感器芯片和负载。吸取50μLTMB底物到所有16个传感器和接近传感器芯片安装。
8. 获取安培法和循环伏安法测量所有16个传感器使用的Helios芯片读卡器。安培的电流是成比例的汇率的TMB r在传感器表面上的排出（参见图1）。

结果

我们描述了同样的结构的双抗体夹心ELISA的电化学检测。在图1中所示，目标核糖体RNA（rRNA基因）杂交，捕获和检测探针开发的催化氧化还原反应的HRP标记的抗荧光素抗体片段结合到探测器上的探针的3'荧光素联动。检测灵敏度的一个重要组成部分是金电极的表面化学性质。我们已经发现，由巯基化的捕获探针，mercaptohexanol，和己二硫醇组成的三元单层显着提高了信号-噪声比通过减...

讨论

这里描述的电化学传感器测定使靶核酸的快速检测。的敏感性和特异性取决于靶 - 探针杂交的自由能，而这又取决于捕获和检测器探针的长度和GC含量的一部分。我们通常执行的的杂交步骤在环境温度（约^{20℃）5，6。}然而，在杂交步骤（3.2和3.3）也可以在杂交烘箱中在较高温度下进行，如果芯片被放置在有盖的腔室，其中包含湿润滤纸，以防止蒸发^7，8。获得最佳的信号与检测器?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
6-mercapto-1-hexanol (MCH)	Sigma	451088	Store at room temperature
1,6-hexanedithiol (HDT)	Sigma	H-12005	Store at room temperature
Thiolated capture probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Fluorescein-modified detector probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Bridging Oligonucleotide	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments	Roche	11 426 346 910	Store at 4 °C
Helios Chip Reader	GeneFluidics	GFR-2009
Sensor Chip Mount	GeneFluidics	GFR-003
Film well sticker	GeneFluidics		Shipped with sensor chips
Bare gold 16-sensor array chips	GeneFluidics	SC1000-16X-B	Store in 100% N2 at room temperature
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906	Store at 4 °C
1M Phosphate Buffer, pH 7.2			0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2
Blocker Casein in PBS	Pierce	37528	Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C
			Table 1. Reagents and Equipment.