גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

Summary

אנו מתארים שיטת assay חיישן אלקטרוכימי לגילוי חיידקים מהיר והזדהות. Assay כרוך מערך חיישנים פונקציונליות עם בדיקות ללכוד oligonucleotide DNA ל( rRNA) רצפי מינים ספציפיים ריבוזומלי RNA. הכלאה כריך של rRNA היעד עם הבדיקה ללכוד ובדיקת גלאי דנ"א oligonucleotide peroxidase צמודת חזרת מייצרת נוכחית amperometric למדידה.

Abstract

חיישנים אלקטרוכימיים נמצאים בשימוש נרחב למדידה מהירה ומדויקת של רמת סוכר בדם, ויכולים להיות מותאם לזיהוי של מגוון רחב של analytes. חיישנים אלקטרוכימיים לפעול על ידי transducing אירוע הוקרה ביולוגי לאות חשמלי שימושי. התמרה אות מתרחשת על ידי צימוד הפעילות של אנזים חיזור לאלקטרודה amperometric. הספציפיות חיישן היא גם מאפיין מהותי של האנזים, גלוקוז אוקסידאז במקרה של חיישן גלוקוז, או תוצר של קשר בין האנזים ונוגדן או הבדיקה.

כאן, אנו מתארים שיטת assay חיישן אלקטרוכימי כדי לזהות באופן ישיר ולזהות חיידקים. בכל מקרה, הבדיקות שתוארו כאן הן oligonucleotides DNA. שיטה זו מבוססת על הכלאה כריך של בדיקות ללכוד וגלאי עם היעד RNA ריבוזומלי (rRNA). הבדיקה ללכוד מעוגנת למשטח החיישן, ואילו הבדיקה הגלאי קשורה לשעותperoxidase orseradish (HRP). כאשר מצע כגון 3,3 ", 5,5"-tetramethylbenzidine (TMB) הוא הוסיף לאלקטרודה עם מתחמים ללכוד יעד גלאים מאוגדים פני השטח שלו, המצע הוא חמצון על ידי HRP ומופחת על ידי אלקטרודה לעבוד. תוצאות מחזור חיזור זה בדילוגים של אלקטרונים על ידי המצע מהאלקטרודה לHRP, ייצור זרימת זרם באלקטרודה.

Introduction

שימוש rRNA כמולקולת מטרה לאיתור וזיהוי חיידקים יש מספר היתרונות. השפע של rRNA בתאי חיידקים מספק לגבול רגישות נמוך כמו 250 חיידקים למ"ל, ללא צורך בהגברת ¹ היעד. rRNA חיידקים מכיל רצפי מינים ספציפיים ייחודיים כי הם נגישים להכלאה עם בדיקות ה-DNA. כתוצאה מכך, מערך של חיישני אלקטרו יכול לשמש כדי לזהות חיידקים לא ידועים, שבו כל חיישן פונקציונלי עם בדיקה ללכוד מינים ספציפיים שונה. חיישני בקרה חיוביים צריכים להיכלל ליעד oligonucleotide סינטטי ש" גשרים "ללכוד ובדיקות גלאים ליצור אות כיול פנימית.

יש חיישנים אלקטרוכימיים מגוון רחב של יישומי מחקר בסיסיים ותרגומים. לדוגמה, assay מתואר כאן נעשה שימוש כדי למדוד את ההשפעה של א 'דווקא שלב צמיחת חיידק בRRNלהעתיק מספרים מראש rRNA ו, שהוא עניין רב לחוקרים המעוניינים בחיידקי פיזיולוגיה ^2. הרגישות של assay חיישן אלקטרוכימי נקבעת על ידי יחס האות לרעש. מגוון רחב של שיטות והגברת אות להפחתת רעש נחקר. אנו מוצאים כי שיפור הכימיה של פני השטח החיישן הוא מפתח לצמצום כריכה ספציפי של בדיקה ו / או אנזים HRP גלאי. בפרט, monolayer מעורבת של alkanedithiols וmercaptohexanol כבר מצא להפחית את הרקע על ידי כיסוי פני האלקטרודה יותר לחלוטין תוך שמירה על הנגישות של הבדיקה ללכוד להכלאת היעד ^3. טיפולי כימיה של פני שטח אלה חשובים במיוחד עבור מבחני הכוללים דגימות ביולוגיות מורכבות.

Protocol

1. Functionalization של חיישנים אלקטרוכימיים

1. הכן את הבדיקה ללכוד thiolated בריכוז של 0.05 מיקרומטר ב300 מיקרומטר 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA ו דגירה בחושך בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות . דגירה של הבדיקה ללכוד thiolated עם HDT מבטיחה כי קבוצת תיאול על הבדיקה ללכוד מצטמצמת, וכתוצאה מכך תוצאות יותר עקביות.
2. החל זרם של חנקן עד 16 שבב מערך החשוף זהב חיישן (ים) למשך 5 שניות כדי להסיר את הלחות ו / או חלקיקים.
3. החל 6 μl של תמהיל הבדיקה ללכוד HDT-thiolated להאלקטרודה העבודה של כל 16 החיישנים של מערך החיישנים ולאחסן את שבב החיישן (ים) בצלחת פטרי מכוסה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בדיקות ללכוד thiolated להיקשר ישירות לאלקטרודה הזהב החשופה וHDT פועל למניעת overpacking של הבדיקות ללכוד ולשמור אותם בקונפורמציה מורחבת שמקדמת הכלאה עם היעד.
4. לאחר היום, לשטוף עם שבב חיישן deionized H ₂ O במשך 2-3 שניות ויבשות תחת זרם של חנקן למשך 5 שניות.
5. החל 6 μl של 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 מ"מ 6 mercapto-1-hexanol (MCH) לאלקטרודה העבודה של כל 16 החיישנים ו דגירה במשך 50 דקות. זה ובכל incubations שבב החיישן הבאים מבוצעים בצלחת פטרי מכוסה בטמפרטורת חדר. MCH פועל כסוכן חסימה, מילוי בכל פערים שבו הבדיקה ללכוד thiolated או HDT לא קיימת על פני השטח האלקטרודה.

2. לדוגמא הכנה

1. העבר 1 מ"ל של תרבות חיידקים בשלב היומן של צמיחה (OD ₆₀₀ ≈ 0.1) לצינור microcentrifuge צנטריפוגות ב XG 16,000 למשך 5 דקות. הסר את supernatant התרבות. יכולה להיות מעובד גלולה החיידקים באופן מיידי או מאוחסנת ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
2. יסודיות resuspend גלולה חיידקים ב10 μl של 1 M NaOH על ידי יישום קצה פיפטה לבוטטום של צינור microcentrifuge וpipetting מעלה ומטה מספר פעמים. דגירה ההשעיה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
3. לנטרל את lysate החיידקים על ידי הוספה של 50 μl 1 חיץ פוספט ', pH 7.2, המכיל 2.5% מ"מ סרום אלבומין (BSA) ושור של 0.25 בדיקה גלאי העמסה-שונה. דגירה lysate נוטרל למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. בדיקות גלאי העמסה-modified להכליא עם מולקולות מטרת rRNA חיידקיים.

3. Assay חיישן אלקטרוכימי

1. שטוף MCH משבב החיישן עם deionized H ₂ O עבור 2-3 שניות ויבשות תחת זרם של חנקן למשך 5 שניות.
2. החל 4 μl של lysate חיידקים נטרל את האלקטרודה לעבודה של כל אחד מחיישני 14 ו דגירה במשך 15 דקות. מתחמי בדיקה יעד גלאים להכליא לבדיקות ללכוד thiolated משותק.
3. החל 4 μl של 1 ננומטר גישור oligonucleotide ב1 חיץ פוספט ', pH 7.2, המכיל BSA 2.5% ו 0.25 μ בדיקה גלאי העמסה-modified M ל2 חיישני בקרה חיוביות (ששמש לנורמליזציה אות) ו דגירה במשך 15 דקות.
4. שטוף את שבב החיישן עם deionized H ₂ O במשך 2-3 שניות ויבשות תחת זרם של חנקן למשך 5 שניות.
5. החל 4 μl של 0.5 U / מ"ל ​​אנטי העמסה-HRP ב1 חיץ פוספט ', pH 7.2, המכיל 0.5% קזאין להאלקטרודה העבודה של כל 16 החיישנים ודגירה במשך 15 דקות. אנטי ההעמסה-HRP נקשר לבדיקות גלאי העמסה-שונה המשותקות.
6. שטוף את שבב החיישן עם deionized H ₂ O במשך 2-3 שניות ויבשות תחת זרם של חנקן למשך 5 שניות.
7. החל סרט גם מדבקה על פני השטח של השבב וחיישן העומס לתוך הר שבב החיישן. פיפטה μl 50 של מצע TMB על כל 16 החיישנים ולסגור את הר שבב החיישן.
8. השג amperometry ומדידות Voltammetry מחזורי לכל 16 חיישני שימוש בקורא צ'יפ הליוס. Amperometric הנוכחי הוא פרופורציונלי לשיעור של TMB Reduction על משטח החיישן (ראה איור 1).

תוצאות

אנו מתארים assay אלקטרוכימי שבנוי באופן דומה לכריך ELISA. כפי שניתן לראות בתרשים 1, יעד ההכלאה ריבוזומלי רנ"א (rRNA) עם בדיקות ללכוד וגלאי שפותחה על ידי תגובת חיזור catalyzed ידי HRP מצומדת לברי נוגדן אנטי העמסה אשר נקלטות על ידי העמסת הצמדה '3 בבדיקת הגלאי. מרכיב חשוב ?...

Discussion

Assay חיישן אלקטרוכימי המתואר כאן מאפשר זיהוי מהיר של מטרות חומצות גרעין. רגישות וסגוליות תלויים בחלקו על האנרגיה החופשית של הכלאה יעד חללית, אשר בתורו תלוי באורך ותוכן GC של הלכידה ובדיקות גלאים. אנחנו בדרך כלל לבצע את פעולות ההכלאה בטמפרטורת הסביבה (~ 20 מעלות צלזיוס)

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
6-mercapto-1-hexanol (MCH)	Sigma	451088	Store at room temperature
1,6-hexanedithiol (HDT)	Sigma	H-12005	Store at room temperature
Thiolated capture probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Fluorescein-modified detector probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Bridging Oligonucleotide	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments	Roche	11 426 346 910	Store at 4 °C
Helios Chip Reader	GeneFluidics	GFR-2009
Sensor Chip Mount	GeneFluidics	GFR-003
Film well sticker	GeneFluidics		Shipped with sensor chips
Bare gold 16-sensor array chips	GeneFluidics	SC1000-16X-B	Store in 100% N2 at room temperature
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906	Store at 4 °C
1M Phosphate Buffer, pH 7.2			0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2
Blocker Casein in PBS	Pierce	37528	Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C
			Table 1. Reagents and Equipment.