전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

요약

우리는 빠른 세균 검출 및 식별을 위해 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 분석은 리보솜 RNA (rRNA의) 종의 특정 시퀀스 DNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 작용 센서 어레이를 포함한다. 캡처 프로브와 고추 냉이 과산화 효소 연결된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 검출기 프로브 대상 rRNA의의 샌드위치 하이브리드는 측정 전류 측정 전류를 생성합니다.

초록

전기 센서가 널리 혈당의 신속하고 정확한 측정을 위해 사용되며, 분석의 다양한 검출에 적용 할 수 있습니다. 전기 센서는 유용한 전기 신호로 생물학적 인식 이벤트를 transducing에 의해 작동합니다. 신호 전달은 전류 측정 전극에 산화 환원 효소의 활동을 결합하여 발생합니다. 센서의 특이성은 고유의 효소의 특성, 포도당 센서의 경우 포도당 산화 효소 또는 효소 항체 또는 프로브 사이의 결합의 산물 중 하나입니다.

여기, 우리가 직접 감지하고 박테리아를 식별하는 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 모든 경우에, 여기에 설명 된 프로브 DNA 올리고 뉴클레오티드이다. 이 방법은 대상 리보솜 RNA (rRNA의)를 캡처 및 검출기 프로브 샌드위치 하이브리드를 기반으로합니다. 검출기 프로브가 시간에 연결되어있는 동안 포획 프로브는 센서 표면에 고정되어orseradish 퍼 옥시 데이즈 (HRP). 같은 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)와 같은 기판 표면에 결합 캡처 표적 탐지기 단지와 전극에 추가되면, 기판은 HRP에 의해 산화 작업 전극에 의해 감소​​된다. 전극에 전류 흐름을 생산, 전극에서 HRP의 기질에 의해 전자의 왕복이 산화 환원 사이클 결과.

서문

세균 검출 및 식별을위한 표적 분자로 rRNA를 사용하면 장점을 가지고 있습니다. 박테리아 세포의 rRNA의의 풍부한 대상 증폭 ¹ 필요없이 밀리리터 당 250 박테리아의 낮은 민감도 제한을 제공합니다. 세균성 rRNA의가 DNA 프로브와 하이브리드 액세스 할 수있는 고유 한 종의 특정 시퀀스를 포함하고 있습니다. 따라서, 전기 센서 배열은 각 센서가 다른 종의 특정 캡처 프로브 기능화되어 알 수없는 박테리아를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 양성 대조군 센서는 "다리"캡처 및 검출기 프로브 내부 교정 신호를 생성 할 수있는 합성 올리고 뉴클레오티드 대상에 대해 포함되어야한다.

전기 센서는 기본 및 translational 연구 애플 리케이션의 넓은 범위가 있습니다. 예를 들어, 분석은 정확하게 E.의 효과를 측정하기 위해 여기에 설명 된 사용되었습니다 RRN에서 대장균의 성장 단계세균 생리학 ^2에 관심있는 연구자들에게 큰 관심입니다 및 사전 rRNA의 사본 번호. 전기 센서 분석의 감도는 노이즈 비율로 신호에 의해 결정됩니다. 신호 증폭 및 소음 감소 방법의 다양한 탐구되었다. 우리는 센서 표면의 화학적 성질을 개선하는 검출기 프로브 및 / 또는 HRP 효소의 비특이적 결합을 줄이는 열쇠는 사실을 알게 될 것입니다. 특히, alkanedithiols 및 mercaptohexanol의 혼합 단층이 대상 하이브리드 ³ 캡처 프로브의 접근성을 유지하면서 더 완전 전극 표면을 커버하여 배경을 줄이기 위해 발견되었습니다. 이러한 표면 화학 처리는 복잡한 생물 학적 샘플을 포함하는 분석에 특히 중요하다.

프로토콜

1. 전기 화학 센서의 작용

1. 300 μM에서 0.05 μM의 농도에서 thiolated 캡처 프로브를 준비하는 1,6 - hexanedithiol (HDT), 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 0.3 M의 NaCl, 10 분 동안 상온에서 어둠 속에서 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화 . HDT와 thiolated 캡처 프로브의 배양 더 일관성있는 결과의 결과로, 포획 프로브의 티올 그룹이 감소되도록합니다.
2. 수분 및 / 또는 미립자를 제거하기 위하여 5 초 동안 노출 된 금 16 센서 어레이 칩 (들)에 질소 스트림을 적용합니다.
3. 센서 배열의 모든 16 센서의 작동 전극에 HDT-thiolated 캡처 프로브 믹스의 6 μl를 적용하고 4 ° C 하룻밤에 덮여 페트리 접시에 센서 칩 (들)을 저장합니다. Thiolated 캡처 프로브는 벌거 벗은 금 전극에 직접 바인딩 및 HDT는 캡처 프로브의 내용물을 과도을 방지하고 목표 하이브리드을 촉진 확장 된 형태에서 그들을 유지하는 역할을합니다.
4. 날 따라 5 초 동안 질소의 흐름에 따라 2 ~ 3 초 건조를위한 이온 H ₂ O와 센서 칩을 씻는다.
5. 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 0.3 M의 NaCl, 1 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 mM의 16 개 센서와 50 분 동안 부화의 작업 전극 6 메르 캅토-1-헥산 (MCH)의 6 μl를 적용합니다. 이 이후의 모든 센서 칩에서 incubate은 상온에서 적용 페트리 접시에서 수행됩니다. MCH는 thiolated 캡처 프로브 또는 HDT가 전극 표면에 존재하지 않는 틈새를 채우는 차단제 역할을합니다.

2. 샘플 준비

1. 5 분 16,000 XG에 microcentrifuge 관 및 원심 분리기 성장의 로그 단계 (≈ 0.1 OD _600)에서 세균성 문화의 1 ML을 전송합니다. 배양 상청액을 제거합니다. 박테리아 펠렛은 즉시 처리 또는 -80 ° C 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다.
2. 철저 봇에 피펫 팁을 적용하여 1 M NaOH를 10 μL에서 박테리아 펠렛을 resuspend을microcentrifuge 관 및 여러 번 위아래로 피펫의 탐. 5 분 상온에서 현탁액을 품어.
3. 1 M 인산 버퍼, 산도 7.2의 50 μl를 추가 형광 - 수정 검출기 프로브의 2.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 0.25 밀리미터를 포함하여 세균 해물을 중화. 실온에서 10 분 동안 중화 해물을 품어. 형광 - 수정 검출기 프로브는 세균성 rRNA의 대상 분자 잡종.

3. 전기 센서 분석

1. 5 초 질소의 흐름에 따라 2 ~ 3 초 건조를위한 이온 H ₂ O와 센서 칩에서 MCH를 씻으십시오.
2. 14 각 센서의 작동 전극에 중화 세균 해물 4 μl를 적용하고 15 분 동안 품어. 대상 검출기 프로브 컴플렉스 고정 thiolated 캡처 프로브에 잡종.
3. 2.5 % BSA 및 0.25 &를 포함, 1 M 인산 버퍼, 산도 7.2 올리고 뉴클레오티드를 브리징 1 nm의 4 μl를 적용MU, M 형광 - 수정 검출기 프로브 2 개의 긍정적 인 제어 센서 (신호 정상화를 위해 사용되는) 15 분 동안 부화.
4. 5 초 질소의 흐름에 따라 2 ~ 3 초 건조를위한 이온 H ₂ O와 센서 칩을 씻으십시오.
5. 1 M 인산 버퍼, 산도 7.2에서 0.5 U / ㎖ 방지 형광-HRP 4 μl를 적용 16 개 센서의 작동 전극에 0.5 %의 카제인을 함유하고 15 분 동안 품어. 안티 - 형광-HRP가 고정화 된 형광 - 수정 검출기 프로브에 바인딩합니다.
6. 5 초 질소의 흐름에 따라 2 ~ 3 초 건조를위한 이온 H ₂ O와 센서 칩을 씻으십시오.
7. 센서 칩 마운트에 센서 칩과 부하의 표면에 잘 필름 스티커를 적용합니다. 피펫 50 16 개 센서 위에 TMB 기질 ㎕의 센서와 칩 마운트를 닫습니다.
8. 헬리오스 칩 리더를 사용하는 모든 16 센서 전류 측정과 순환 전압 전류 법 측정을 얻습니다. 전류 측정 전류는 TMB R의 속도에 비례센서 표면에 배기관 (그림 1 참조).

결과

우리는 샌드위치 ELISA와 유사하게 구성되어 전기 화학적 분석을 설명합니다. 그림 1, 검출기 프로브에 3 '형광 결합에 바인딩 방지 형광 항체 단편을 결합 HRP에 의해 촉매 산화 환원 반응에 의해 개발 캡처 및 검출기 프로브를 대상 리보솜 RNA (rRNA의) 하이브리드에 표시. 분석 감도의 중요한 구성 요소는 금 전극의 표면 화학입니다. 우리는 thiolated 캡처 프로브, mercaptohexanol 및 hexanedith...

토론

여기에 설명 된 전기 센서 분석은 핵산 표적을 신속하게 탐지 할 수 있습니다. 민감도와 특이도가 차례로 길이 캡처 및 검출기 프로브의 GC 내용에 따라 대상 프로브 하이브 리다이 제이션의 자유 에너지에 부분적으로 의존한다. 우리는 일반적으로 주위 온도 (~ 20 ° C) ^{5, 6에서} 하이브리드 단계를 수행하십시오. 그러나 하이브리드 단계 (3.2, 3.3)는 칩이 포함 된 커버 챔버에 배치됩니다 경우...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
6-mercapto-1-hexanol (MCH)	Sigma	451088	Store at room temperature
1,6-hexanedithiol (HDT)	Sigma	H-12005	Store at room temperature
Thiolated capture probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Fluorescein-modified detector probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Bridging Oligonucleotide	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments	Roche	11 426 346 910	Store at 4 °C
Helios Chip Reader	GeneFluidics	GFR-2009
Sensor Chip Mount	GeneFluidics	GFR-003
Film well sticker	GeneFluidics		Shipped with sensor chips
Bare gold 16-sensor array chips	GeneFluidics	SC1000-16X-B	Store in 100% N2 at room temperature
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906	Store at 4 °C
1M Phosphate Buffer, pH 7.2			0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2
Blocker Casein in PBS	Pierce	37528	Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C
			Table 1. Reagents and Equipment.