Bacterial Detección e Identificación Usando sensores electroquímicos

Resumen

Se describe un método de ensayo sensor electroquímico para la detección e identificación bacteriana rápida. El ensayo implica una serie de sensores funcionalizado con sondas de captura de oligonucleótidos de ADN para ARN ribosomal (ARNr) secuencias específicas de la especie. Sandwich hibridación de ARNr objetivo con la sonda de captura y una sonda de oligonucleótido detector de ADN unido a peroxidasa de rábano picante produce una corriente amperométrica medible.

Resumen

Los sensores electroquímicos se utilizan ampliamente para una rápida y precisa medición de la glucosa en la sangre y se pueden adaptar para la detección de una amplia variedad de analitos. Los sensores electroquímicos operan por transducción de un evento de reconocimiento biológico en una señal eléctrica útil. La transducción de señales se produce mediante el acoplamiento de la actividad de una enzima redox a un electrodo amperométrico. Especificidad del sensor es ya sea una característica inherente de la enzima, la glucosa oxidasa en el caso de un sensor de glucosa, o un producto de la vinculación entre la enzima y un anticuerpo o sonda.

A continuación, describimos un método de ensayo sensor electroquímico para detectar e identificar bacterias directamente. En todos los casos, las sondas descritas aquí son oligonucleótidos de ADN. Este método se basa en sándwich de hibridación de sondas de captura y el detector con objetivo de ARN ribosómico (ARNr). La sonda de captura está anclado a la superficie del sensor, mientras que la sonda detectora está vinculada a horseradish peroxidasa (HRP). Cuando se añade un sustrato tal como 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) a un electrodo con complejos de captura-meta-detector unidos a su superficie, el sustrato se oxida por el HRP y reduce en el electrodo de trabajo. Este ciclo redox resultados, en el transporte de electrones por el sustrato del electrodo con HRP, producir flujo de corriente en el electrodo.

Introducción

Uso de rRNA como una molécula diana para la detección e identificación bacteriana tiene una serie de ventajas. La abundancia de ARNr en las células bacterianas prevé un límite de sensibilidad tan bajo como 250 bacterias por mililitro y sin la necesidad de amplificación de la diana ^1. RRNA bacteriano contiene secuencias únicas especies específicas que son accesibles a la hibridación con sondas de ADN. En consecuencia, una serie de sensores electroquímicos se puede utilizar para identificar las bacterias desconocidos, donde cada sensor está funcionalizado con una sonda de captura específica de la especie diferente. Sensores del control positivo deben ser incluidos para un objetivo oligonucleótido sintético que "puentes" de la captura y las sondas de detección para crear una señal de calibración interna.

Los sensores electroquímicos tienen una amplia gama de aplicaciones de investigación básica y de la traducción. Por ejemplo, el ensayo descrito aquí se ha utilizado para medir con precisión el efecto de la E. coli en fase de crecimiento rrnA y el número de copias pre-rRNA, que es de gran interés para los investigadores interesados ​​en la fisiología bacteriana ^2. La sensibilidad del ensayo sensor electroquímico se determina por la relación señal a ruido. Se han explorado una diversidad de amplificación de la señal y los métodos de reducción de ruido. Nosotros encontramos que la mejora de la química de la superficie del sensor es clave para reducir la unión no específica de la sonda detector y / o enzima HRP. En particular, se ha encontrado una monocapa mixta de alkanedithiols y mercaptohexanol para reducir fondo, cubriendo la superficie del electrodo de forma más completa al tiempo que conserva la accesibilidad de la sonda de captura para la hibridación de destino ^3. Estos tratamientos química de la superficie son particularmente importantes para los ensayos que implican muestras biológicas complejas.

Protocolo

1. Funcionalización de sensores electroquímicos

1. Prepare la sonda de captura tiolada a una concentración de 0,05 mM en 300 mM de 1,6-hexanoditiol (HDT), 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM de EDTA y se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min . La incubación de la sonda de captura tiolado con HDT asegura que se reduce el grupo tiol de la sonda de captura, lo que resulta en resultados más consistentes.
2. Aplicar una corriente de nitrógeno a 16 de oro desnudo chip de matriz de sensores (s) durante 5 segundos para eliminar la humedad y / o partículas.
3. Aplicar 6 l de la mezcla de sonda de captura HDT-tiolada al electrodo de trabajo de los 16 sensores de la serie de sensores y almacenar el chip del sensor (s) en un plato cubierto Petri a 4 ° C durante la noche. Sondas de captura tiolado se unen directamente al electrodo de oro desnudo y la HDT actúa para prevenir embalaje excesivo de las sondas de captura y mantenerlos en una conformación extendida que promueve la hibridación con el objetivo.
4. Latras día, lavar el chip sensor con _H2O desionizada durante 2-3 seg y seco bajo una corriente de nitrógeno durante 5 seg.
5. Aplicar 6 l de 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) para el electrodo de trabajo de todos los sensores 16 y se incuba durante 50 min. Esta y todas las incubaciones posteriores chip sensor se llevan a cabo en una placa de Petri cubierta a temperatura ambiente. MCH actúa como un agente de bloqueo, debería llenar los vacíos en donde la sonda de captura tiolado o HDT no está presente en la superficie del electrodo.

2. Preparación de la muestra

1. Se transfiere 1 ml de cultivo bacteriano en la fase logarítmica de crecimiento (OD ₆₀₀ ≈ 0,1) a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga a 16.000 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante del cultivo. El sedimento bacteriano se puede procesar inmediatamente o se almacenó a -80 ° C para su uso posterior.
2. Completamente resuspender el pellet bacteriano en 10 l de NaOH 1 M aplicando la punta de la pipeta en el bottom del tubo de microcentrífuga y pipeta hacia arriba y abajo varias veces. Se incuba la suspensión a temperatura ambiente durante 5 min.
3. Neutralizar el lisado bacteriano mediante la adición de 50 l de tampón fosfato 1 M, pH 7,2, que contiene 2,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,25 mM de una sonda de detector de fluoresceína-modificado. Se incuba el lisado neutralizado durante 10 min a temperatura ambiente. Fluoresceína modificados con sondas detectoras se hibridan con moléculas diana de rRNA bacterianas.

3. Sensor electroquímico Ensayo

1. Lavar la MCH desde el chip sensor con _H2O desionizada durante 2-3 seg y seco bajo una corriente de nitrógeno durante 5 seg.
2. Aplicar 4 l de lisado bacteriano neutralizado al electrodo de trabajo de cada uno de los sensores 14 y se incuba durante 15 min. Complejos de sonda para la diana-detector se hibridan con sondas de captura inmovilizadas tiolados.
3. Aplicar 4 l de 1 nM puente oligonucleótido en tampón fosfato 1 M, pH 7,2, que contiene 2,5% de BSA y 0,25 ymu, M sonda detector de fluoresceína-modificado a 2 sensores de control positivo (utilizados para la normalización de la señal) y se incuba durante 15 min.
4. Lavar el chip sensor con _H2O desionizada durante 2-3 seg y seco bajo una corriente de nitrógeno durante 5 seg.
5. Aplicar 4 l de 0,5 U / ml de anti-fluoresceína-HRP en tampón fosfato 1 M, pH 7,2, que contiene 0,5% de caseína al electrodo de trabajo de todos los sensores 16 y se incuba durante 15 min. El anti-fluoresceína-HRP se une a las sondas detectoras fluoresceína-modificados inmovilizados.
6. Lavar el chip sensor con _H2O desionizada durante 2-3 seg y seco bajo una corriente de nitrógeno durante 5 seg.
7. Aplicar una película así adhesivo a la superficie del chip sensor y la carga en el chip de montaje del sensor. Añadir 50 l de sustrato TMB a los 16 sensores y cerrar el montaje chip sensor.
8. Obtener amperometría y las medidas de voltametría cíclica de los 16 sensores utilizando el Helios Lector Chip. Amperométrico actual es proporcional a la tasa de TMB reducción en la superficie del sensor (véase la Figura 1).

Resultados

Se describe un ensayo electroquímico que está estructurado de manera similar a un sándwich ELISA. Como se muestra en la Figura 1, diana ribosómica hibridación de ARN (ARNr) con sondas de captura y el detector es desarrollado por una reacción redox catalizada por HRP conjugado con fragmentos de anticuerpo anti-fluoresceína que se unen a la 3 'vinculación fluoresceína en la sonda detectora. Un componente importante de la sensibilidad del ensayo es la química de la superficie del electrodo de...

Discusión

El ensayo de sensor electroquímico descrito aquí permite la rápida detección de dianas de ácido nucleico. La sensibilidad y la especificidad dependen en parte de la energía libre de hibridación diana-sonda, que a su vez depende de la longitud y contenido de GC de la captura y sondas detectoras. Normalmente realizamos los pasos de hibridación a temperatura ambiente (~ 20 ° C) ^{5, 6.} Sin embargo, las etapas de hibridación (3.2 y 3.3) también se puede realizar a temperaturas más elevadas en un horno d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
6-mercapto-1-hexanol (MCH)	Sigma	451088	Store at room temperature
1,6-hexanedithiol (HDT)	Sigma	H-12005	Store at room temperature
Thiolated capture probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Fluorescein-modified detector probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Bridging Oligonucleotide	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments	Roche	11 426 346 910	Store at 4 °C
Helios Chip Reader	GeneFluidics	GFR-2009
Sensor Chip Mount	GeneFluidics	GFR-003
Film well sticker	GeneFluidics		Shipped with sensor chips
Bare gold 16-sensor array chips	GeneFluidics	SC1000-16X-B	Store in 100% N2 at room temperature
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906	Store at 4 °C
1M Phosphate Buffer, pH 7.2			0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2
Blocker Casein in PBS	Pierce	37528	Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C
			Table 1. Reagents and Equipment.