使用时间的推移显微镜可视化缺氧诱导假死<em&gt; C.线虫</em&gt;胚胎

Anastacia M. Garcia; Mary L. Ladage; Pamela A. Padilla

doi:10.3791/4319

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摘要
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摘要

这里描述的是一个技术图像亚细胞结构在动物中使用的气体流通过在纺丝盘共聚焦显微镜连同microincubation室暴露于缺氧。这种方法非常简单，具有足够的灵活性，以适应各种实验参数和模型系统。

摘要

已caenorhabdits线虫广泛使用在研究的胁迫抗性的成人和胚胎阶段的透明度，以及由遗传突变体和转基因株表达融合蛋白^1-4无数的可用性，这是便利的。此外，可以被视为使用荧光标记的记者蛋白的动态过程，如细胞分裂。有丝分裂的研究，可以促进通过使用时间推移实验在各种系统中，包括完整的生物体，因此早期C.线虫的胚胎非常适合这项研究。这里介绍的是一种技术，其中在响应于缺氧（纯度为99.999％的N _2的 <2 ppm O _2） 在体内成像的亚细胞结构应力是可能使用一个简单的气体流通过安装在一个高功率的显微镜。，甲microincubation室中使用结合用氮气流过和纺丝盘共聚焦显微镜创建一个受控的环境，在该环境中的动物可以在体内成像。用GFP标记的伽玛微管蛋白和组蛋白的动力学和逮捕的细胞分裂，可监视之前，期间和之后暴露于缺氧的环境。这种技术的高分辨率，详细的视频和图像的细胞结构内暴露于缺氧的胚胎卵裂球的结果。

研究方案

1。样品制备

生产或获得适当的转基因C.线虫应变计用转基因的方法，或从秀丽隐杆线虫基因联合中心（CGC），或同事。在这种情况下，我们使用的菌株TH32（ 馅饼1 :: TBG-1 :: GFP饼1 :: GFP :: ^H2B）5可视化标记细胞分裂染色体和中心体。
生成一个同步的人口使用以下三种方法之一：1）瓦解妊娠成人次氯酸钠溶液，并使用剩余的胚胎，2）种子盘上挑妊娠的成年人，让他们打下的胚胎1-2小时，或3）挑L4幼虫从混合的人口和移动到一个新的种子板。
成长线虫在20°C至妊娠年轻的成年，这将需要约96小时孵化，从L1幼虫的72小时或24小时后L4蜕皮。 在子宫内的胚胎（2-20芯）含有大量的卵裂球核是最佳的成像子细胞和亚核的变化，分别。这种方法提供了一种手段来提供的青壮年人口早期胚胎，含有丰富的。

2。设置幻灯片的制备及缺氧商会

一个的湿热试验箱持有预制玻片，放置在一个大培养皿或垃圾桶的盖子覆盖着相当规模的湿纸巾。
准备熔融的2％琼脂糖在去离子H _{2 O，}通过加热在玻璃器皿的混合物通过微波或水浴。
将1-3滴在干净的玻璃载玻片温暖的琼脂糖。立即放置一个第二滑动翻转顶部琼脂糖滴（）垂直，按略有，使所得焊盘是薄的和不含气泡。
等待一段时间，冷却，慢慢分开的两个显微镜玻片上，留下一个完整的幻灯片的琼脂糖凝胶垫。重要的是要确保琼脂糖垫是足够薄，不interfe重新聚焦显微镜的能力。能力，可视化样本也是依赖于使用中的目标的特定的光学距离之间的显微镜，它可以改变。
使用干净的刀片塑造成一个小正方形琼脂糖凝胶垫。储存在准备湿热试验箱，直到准备使用。
仔细，使用相同的清洁刀片，采取琼脂糖垫的边缘，并将其转移到一个圆形的25 mm微型盖玻片从滑动，避免垫下方的气泡的积累。选择使用适合的圆形玻璃罩适当在microincubator。
添增下拉到琼脂糖垫作为麻醉剂使用的麻醉剂（0.5％三卡因，在M9缓冲液中的0.05％四咪唑）。选择5-10蠕虫和地方麻醉剂的下降。允许1-3分钟蠕虫停止运动。
成人的子宫内，观察胚胎代替解剖胚，的理由是，以减少潜在的胚胎desiccaTION和由于氮气流横跨胚胎运动。
立即加一滴卤烃油在上面的蠕虫病毒，防止蠕虫脱水，气体流过腔。由于卤烃油是粘性的，可以用一个的枪头或尖端的蠕虫挑到的蠕虫收集石油和下降的。
含有蠕虫的圆形玻璃罩一旦准备就绪后，莱顿的两半封闭的灌注microincubator是分离的，盖玻片，然后小心地直立放置到底环。双方室紧紧地握在一起，然后关闭。
然后将腔室连接到氮气罐经由柔性塑料管，并放置到适当的位置上的显微镜载物台（ 图1C）。在这个时候管和microincubator的应仔细检查是否有泄漏的油管和会议厅一侧的端口插头沿确保安全的依恋。人们可以AL如此轻率地散布少量的肥皂水，看是否有气泡，如果存在泄漏，这将形成管。

3。显微镜在缺氧

定位在低倍率的动物，然后，移动到合适的更高的放大倍率（此应用程序的64倍），图像的兴趣，如在成人的胚胎卵裂球或卵母细胞的组织或细胞。打开的488 nm的激光，以查看GFP信号和定位GFP融合蛋白在细胞中（s）的权益。
阻滞细胞周期阻滞在特定阶段的可视化（如下旬前期）确定一个卵裂球在前一阶段的细胞分裂（ 例如，后期相间或早期前期）。如中心粒的位置，染色体缩合开始，染色体上的位置和核膜的存在或不存在的细胞标记将帮助确定细胞周期阶段（ 图2A）。
用氮气（99.999％的腔室，然后灌注N ₂ <2 ppm的O _2）。在这种情况下，我们使用了一个6 psi的压力，但是压力可能需要根据每个microincubator大小和在使用的管子的直径进行调整和优化。继续监测卵裂球（S）的氮充满室，调整焦平面必要的。
在这一点上，已经开始的时间推移成像。成像时，只要有必要进行捕获感兴趣的现象，在这种情况下前期逮捕和对接核膜内的染色体。图像不超过30分钟，每10秒一次。的图像捕获和设置，例如增益和激光功率的频率应根据需要调整。
取决于缺氧曝光后对细胞周期的阶段，在该时间内的胚胎回应缺氧环境可以改变。通常情况下，缺氧诱导前期逮捕发生在20-30分钟开始氮气流。我们观察到缺氧诱导细胞周期阻滞occuRRING于<20分钟。的图像可以在这段时间帧的方式获得，或可以分离出特定的图象，从时间推移系列购买。另外一个选择是使用视频显微镜胚胎中的亚细胞结构可视化。
要记录从缺氧诱导被捕的状态恢复，气体被关闭和室被允许返回到常氧的扩散，同时记录时间的推移系列。恢复出坞染色体的细胞周期进程，通常发生在5-20分钟的氮气。
请注意，在另外的实验中，一个缺氧指示器，刃天青，被安置在流体可通过的微容器，它被确定腔室变得缺氧氮气气流已经开始后约19分钟内的平均。
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