In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize&#39;a Time Lapse Mikroskopi kullanın<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyolar

Özet

Bir burada tarif edilmekte In vivo tekniktir. Bu yöntem basit ve deneysel parametreleri ve model sistemleri çeşitli uyacak kadar esnek.

Özet

Caenorhabdits elegans yetişkin ve embriyo aşamalarında şeffaflık yanı sıra füzyon proteinleri ^1-4 sayısız ifade genetik mutantlar ve transgenik suşların durumu kolaylaştırılır strese dayanıklılığı çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, hücre bölünmesi gibi dinamik süreçleri floresan etiketli muhabiri proteinleri kullanılarak izlenebilir. Mitoz çalışma dokunulmamış organizmalar dahil olmak üzere çok çeşitli sistemler de hızlandırılmış deneylerinin kullanılmasıyla kolaylaştırılabilir ve böylece ilk C. elegans embriyo de bu çalışma için uygundur. Yüksek güçlü bir mikroskop kurulum ile basit bir gaz akışı kullanarak stres mümkündür; Sunan burada anoksik yanıt (<2 ppm O _2% 99.999 N ₂₎ alt hücresel yapıların in vivo görüntüleme hangi bir tekniktir. Bir microincubation odasından geçen azot gazı akışı ve dönen bir disk konfokal mikroskop ile birlikte kullanılırhayvanlarda in vivo yansıması hangi kontrollü bir ortam oluşturmak için. Kullanma GFP etiketli gama tübülin ve histon, dinamikleri ve hücre bölünmesi tutuklama sırasında ve bir oksijen-yoksun ortama maruz kaldıktan sonra, önce izlenebilir. Bu tekniğin sonuçları oksijen yoksunluğu maruz embriyoların blastomer içinde yüksek çözünürlüklü, ayrıntılı video ve hücresel yapıların görüntülerdir.

Protokol

1. Örnek Hazırlanması

1. Uygun transgenik C. üretin ya da elde elegans transgenik metodolojiler kullanarak faiz veya Caenorhabditis Genetik Stok Merkezi (CGC) veya iş arkadaşından süzün. Hücre bölünmesi için belirteç olarak kromozomlar ve sentrozomlarda görselleştirmek için ^5; Bu durumda biz (pasta-1 :: GFP :: H2B pasta-1 :: TBG-1 :: GFP) suşu TH32 kullanıyorsunuz.
2. Üç yöntemden birini kullanarak senkronize bir nüfus oluşturun: 1) hipoklorit solüsyonu içinde gebe yetişkin parçalanır ve bir numaralı seribaşı tabağa gravid yetişkin almak ve onları 1-2 saat süreyle embriyolar bırakmanı kalan embriy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Ciddi oksijen yoksunluğu (anoksi) maruz C. elegans embriyo gelişimi ve hücre bölünmesi ⁷ dahil biyolojik süreçleri tutuklayarak hayatta edebiliyoruz. Hücre bölünmesi anoksi indüklenen tutuklama hayvanlarda in vivo yansıması hangi kontrollü bir ortam yaratmak yoluyla azot gazı akışı ve dönen bir disk konfokal mikroskop ile birlikte bir microincubation odası kullanarak, bir alt-hücresel düzeyde, izlenebilir (Şekil 1). Ilgi Hücresel yapıları çeşitli .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Oksijen Yoksunluğu ve Asma Animasyon

Ciddi oksijen yoksunluğu maruz bazı organizmalar için ölümcül olabilir rağmen, bazı organizmalar anoksi maruz hayatta edebiliyoruz. C. halinde elegans, anoksi maruziyet sağkalım gelişim safhasına ve anoksi yanıtın bağlıdır girişi gözlemlenebilir biyolojik süreçlerin bir dizi tutuklandı edildiği askıya animasyon bir tersinir durum içine. Oksijen ortamında ^7,9 tekrar geri kadar Hücre bölünmesi, gelişm.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifler / Ekipman			Kompozisyon
Hipoklorit solüsyonu			0.7 g KOH, 12 ml% 5 NaOCİ, GKD 2 0 ile 50 ml'ye getirmek
M9 tampon			3 g KH 2 PO 4, 11 gr Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 L GKD 2 O başına 1 ml (1 M) MgSO4
Cam mikroskop slaytlar	Fisher Scientific	12-550-343	3 "x1" x1.0 mm
Yuvarlak mikro coverglass	Elektron Mikroskopi Bilimleri	72223-01	25 mm Çap
Halokarbon yağı 700	Sigma	H8898-100ml
Anestetik			% 0.5 gastrikaine,% 0.05 Tetramisole
Leiden Kapalı Perfüzyon Microincubator	Harvard Apparatus	650041
UHP Azot	Calgaz (Air Liquide)		> 99,9990% N 2 <2 ppm O 2
Plastik boru	VWR	89068-468	0.062 "ID x 0.125" OD
Disk Konfokal Mikroskop Spinning	McBain Sistemleri		Zeiss optik mikroskop, Epifloresans aydınlatma sistemi, CSU-10 Yokogawa konfokal tarayıcı, Hamamatsu elektron çoğaltıcı CCD kamera ters.