における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微​​鏡の使用<em&gt; Cエレガンス</em&gt;胚

要約

ここで説明テクニック。この方法は簡単で、実験パラメータとモデルの様々なシステムに適合するように十分な柔軟性を備えています。

要約

Caenorhabditsエレガンスは、成人と胎児の段階の透明度だけでなく、融合タンパク質^1-4の無数を表現する遺伝子変異体およびトランスジェニック系統の可用性によって促進されるストレス耐性、の研究に広く用いられている。また、このような細胞分裂のような動的なプロセスは、蛍光標識したレポータータンパク質を使用して表示できます。有糸分裂の研究は、無傷の生物を含む様々なシステムでタイムラプス実験の使用によって容易にすることができ、したがって初期のC.線虫の胚はよくこの研究に適しています。ここで紹介する無酸素に応答して、それによって細胞内構造のin vivoイメージング技術（99.999％N _2、<2 ppmのO _2）があるストレスが高倍率の顕微鏡でのセットアップを使用した単純なガスの流れを使用することで可能です。 microincubation室が通じ窒素ガスの流れと回転するディスク共焦点顕微鏡と組み合わせて使用​​され動物は、in vivoで画像化することができる管理された環境を作成することができます。 GFPタグガンマチューブリンやヒストン用いて、ダイナミクスと細胞分裂の逮捕は、酸素欠乏環境にさらされている間と後に、前に、監視することができます。この手法の結果は、酸素欠乏にさらされた胚の割球内の高解像度、詳細なビデオや細胞構造のイメージです。

プロトコル

1。試料調製

1. 適切なトランスジェニックCを生成または取得elegansはトランスジェニックの手法を用いて、関心のあるまたは線虫遺伝ストックセンター（CGC）や同僚への負担が少なくなります。細胞分裂のマーカーとして染色体や中心体を視覚化するために^5;このケースでは、（PIE-1 :: GFP ::パイH2B-1 :: TBG-1 :: GFP）株TH32を使用しています。
2. 3つの方法のいずれかを使用して同期化された集団を生成する：1）次亜塩素酸溶液中で妊娠成人を崩壊させ、残りの胚^6を使用^して 、2）播種板上に妊娠成人をピックアップし、それらを1〜2時間のために胚を置く、または3）L4を選ぶことができ混合集団とmoveから新しいシードプレートに幼虫。
3. 孵化から約96時間かかります妊娠青年期、〜20℃、L1幼虫または24時間後、L4の脱皮から72時間で線虫を育てています。 子宮内で胚（2-20セル）IMAGに最適な大割球と核を含むるサブ携帯とサブ核の変化であった。この方法論は、初期胚の豊富な数を含む若年成人の集団を生成する手段を提供します。

2。スライドの調製と酸素欠乏症商工会議所は、設定

1. 十分なサイズの蓋で覆われた大きなシャーレまたはビンの内側に湿らせたペーパータオルを配置することによって準備されたスライドを保持するために、湿潤チャンバーを作る。
2. マイクロ波あるいは水浴を介してガラスに混合物を加熱することにより脱イオンH ₂ Oで溶融2％アガロースを準備します。
3. きれいなガラス顕微鏡スライド上に暖かいアガロースの1-3滴を置きます。直ちにアガロースドロップ（複数可）の上に垂直に反転した2枚目のスライドを配置し、その結果、パッドが薄いと気泡の自由になるように少し押します。
4. クールゆっくりとスライドの1つ上のアガロースパッドはそのままにして2顕微鏡スライドを分解する時間を確保します。アガロースパッドがinterfeないように十分に薄いようにすることが重要です後で顕微鏡を集中する能力を使用して再。サンプルを視覚化する能力はまた、顕微鏡間で異なることができ、使用中の特定の目的の光学距離に依存する。
5. 小さな正方形にアガロースパッドを形成するためにクリーンなかみそりの刃を使用しています。使用する準備ができるまで準備湿潤チャンバーに保管してください。
6. 慎重に、同じクリーンなカミソリの刃を用いて、アガロースパッドの端を取るとラウンド25ミリメートルマイクロカバーガラス上にスライドからそれを転送し、パッドの下に気泡の蓄積を回避する。使用するために選択した丸いカバーガラスはmicroincubatorで適切にフィットします。
7. 麻酔薬として使用するためのアガロースパッドに麻酔薬（0.5％tricaine、M9のバッファ内の0.05％tetramisole）のドロップを追加します。麻酔薬のドロップに5月10日ワームや場所を選ぶ。動きを止めるためにワームの1から3分を許可します。
8. 成人子宮内の胎児を観察するための理論的根拠はなく、解剖した胚は、胚desiccaの可能性を最小限にすることですると胚全体で窒素ガスの流れによる移動。
9. すぐにガスがチャンバを通して流されるように脱水からワームを防ぐために、ワームの上にハロカーボンオイルを一滴を追加します。ハロカーボン油は粘性があるので、一つはワームワームにオイル·アンド·ドロップを収集するために選ぶのピペットチップまたはチップを使用することができます。
10. 一度ワームを含む円形カバーガラスの準備が整ったので、ライデン閉鎖灌流microincubatorの二つの部分を分離し、カバーガラスを慎重にボトムリングに直立して配置されます。チャンバーの両側は、その後しっかりと一緒に閉鎖されています。
11. チャンバーはその後、柔軟なプラスチックチューブを介して窒素ガスをタンクに接続されており、顕微鏡ステージ（ 図1C）の適当な位置に配置されます。この時チューブとmicroincubatorは慎重にチューブのチャンバの側面に沿ってポートプラグの確実な取り付けを確実にすることによって、任意の漏れがないかチェックする必要があります。一つは、ALができますとても軽くリークが存在するかどう形成する気泡を探すためにチューブを介してSOAP少量の水を広める。

3。酸素欠乏症で顕微鏡

1. 低倍率で動物を見つけ、その後、そのような大人の胚割球や卵母細胞のような関心の画像組織または細胞に適した高倍率（このアプリケーションの64倍）に移動します。 GFPシグナルを表示し、目的の細胞（s）のGFP融合タンパク質を見つけるために488nmのレーザーをオンにします。
2. 細胞周期停止の特定の段階で逮捕を可視化するために（ 例えば、前期の後期）細胞分裂の前段階（ 例えば後期中間期または早期前期）で割球を識別します。このような中心小体の位置、染色体凝縮の開始、染色体の場所と核膜の有無などの細胞マーカーは、細胞周期段階（ 図2A）を識別するのに役立ちます。
3. チャンバーは、窒素ガス（99.999％で灌流さN _2、<2 ppmのO _2）。我々は6 psiの圧力を使用しかし、この場合には圧力が各microincubatorのサイズと、使用中のチューブの直径に応じて調整し、最適化する必要があるかもしれません。窒素は、必要に応じて焦点面を調整し、チャンバーを埋めるように割球（s）を継続的に監視します。
4. この時点で、タイムラプスイメージングが始まりました。イメージングは​​、核の内膜に染色体のこの場合前期の逮捕とドッキングで、興味のある現象を捕捉するために必要な限りのために行われている。画像は30分を超えないために10秒ごとに一度取られます。画像キャプチャとゲインやレーザパワー等の設定の周波数が必要に応じて調整されるべきである。
5. 胚は無酸素環境に対応する時間は無酸素暴露時に細胞周期の段階に応じて変えることができる。一般的に酸素欠乏によって誘導された前期の逮捕は、窒素ガス流を開始してから20〜30分以内に起こる。我々は、酸素欠乏によって誘導された細胞周期停止occuを観察している<20分でRRING。画像はこの時間枠の間に取得することができる、または特定の画像は後でタイムラプスシリーズから単離することができる。追加のオプションは、胚で細胞内構造を可視化するビデオ顕微鏡を使用することです。
6. 酸素欠乏によって誘導された逮捕された状態からの回復を文書化するために、ガスがオフになっていて、チャンバーをタイムラプスシリーズを記録しながら、拡散によって酸素正常状態に戻ることを許可されています。染色体の細胞周期の進行およびドッキング解除の再開は、典型的には窒素ガスをオフにして5〜20分以内に起こる。
7. 別の実験では無酸素インジケーター、レサズリンは、フロースルーマイクロチャンバ内に配置されたことに注意してください、それは窒素ガスフローが開始された後チャンバーは約19分の平均で無酸素になることを決定した。
8. 画像と動画は、Imaris、イメージJまたはPhotoshopを使用して処理し、ディスプレイ用のQuickTimeにインポートされます。

結果

深刻な酸素欠乏（無酸素）にさらさC. elegansの胚は、開発や細胞分裂^7を含む生物学的プロセスを停止させることで生き残ることができます。細胞分裂の酸素欠乏によって誘導された逮捕は、動物は、in vivoで画像化することができる管理された環境を作成することによる窒素ガスの流れと回転するディスク共焦点顕微鏡と組み合わせてmicroincubation室を使用することによっ?...

ディスカッション

酸素欠乏と仮死状態

深刻な酸素欠乏への曝露は、いくつかの生物にとって致命的なことができますが、いくつかの生物が無酸素への暴露を生き抜いてきた。 Cの場合にはelegansは 、無酸素暴露の生存率は、発達段階や酸素欠乏に対する応答に依存するエントリが観察可能な生物学的プロセスの数が逮捕された仮死状態に可逆的である。酸素は環境^7,9に再...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/機器			構図
次亜塩素酸塩溶液			0.7グラムのKOH、12ミリリットルの5％次亜塩素酸ナトリウムは、蒸留H 2 0で50mlにもたらす
M9バッファー			3グラムのKH 2 PO 4、11グラムのNa 2 HPO 4、5gのNaCl、1リットルの蒸留H 2 Oあたり1ミリリットル（1 M）のMgSO 4を
ガラス顕微鏡スライド	フィッシャー·サイエンティフィック	12-550-343	3 "×1" X1.0さmm
ラウンドマイクロカバーガラス	電子顕微鏡学	72223から01	直径25mm
ハロカーボン油700	シグマ	H8898-100ML
麻酔薬			TRIC 0.5パーセントアイネ、0.05％tetramisole
ライデンクローズド灌流Microincubator	ハーバード装置	650041
超高純度窒素	Calgaz（エア·リキード）		> 99.9990パーセントのN 2 <2 ppmのO 2
プラスチックチューブ	VWR	89068-468	0.062 "内径x 0.125" OD
ディスク共焦点顕微鏡をスピニング	マクベインシステムズ		ツァイスは光学顕微鏡、落射照明系、CSU-10横河電機共焦点スキャナ、浜松電子増倍CCDカメラを反転します。