Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen

Zusammenfassung

Hier wird beschrieben ein In vivo Technik zur Bilder subzellulären Strukturen in Tieren, die mit Anoxie einen Gasstrom durch microincubation Kammer in Verbindung mit einer drehenden Scheibe Konfokalmikroskop. Dieses Verfahren ist einfach und flexibel genug, um eine Vielzahl von experimentellen Parameter und Modellsystemen anzupassen.

Zusammenfassung

Caenorhabdits elegans wurde ausgiebig in der Studie der Stressresistenz, die durch die Transparenz des adulten Stadien und Embryo als auch durch die Verfügbarkeit von genetischen Mutanten und transgenen Linien Expression einer Vielzahl von Fusionsproteinen ^1-4 erleichtert wird. Darüber hinaus können dynamische Prozesse wie Zellteilung Darstellung unter Verwendung von fluoreszierend markierten Reporter-Proteine ​​werden. Das Studium der Mitose kann durch den Einsatz von Zeitrafferexperimente in verschiedenen Systemen einschließlich intakten Organismen erleichtert; somit der frühen C. elegans Embryo wird auch für diese Studie geeignet. Präsentiert hier ist eine Technik, mit der in vivo Bildgebung von sub-zellulären Strukturen in Reaktion auf Sauerstoffmangel (99,999% N _2; <2 ppm O ₂₎ Stress ist möglich, mit einem einfachen Gasfluss durch Setup auf einem High-Power-Mikroskop. Ein microincubation Kammer in Verbindung mit Stickstoffgas durchströmt und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop verwendetum eine kontrollierte Umgebung, in der Tiere in vivo abgebildet werden können. Verwendung GFP-markierten Gamma-Tubulin und Histon, kann die Dynamik und Verhaftung der Zellteilung kontrolliert werden, bevor, während und nach der Einwirkung von einer sauerstoffarmen Umgebung. Die Ergebnisse dieser Technik sind hochauflösende, detaillierte Videos und Bilder von zellulären Strukturen innerhalb Blastomeren von Embryonen ausgesetzt Sauerstoffmangel.

Protokoll

Ein. Probenvorbereitung

1. Produzieren oder zu erhalten entsprechenden transgenen C. elegans-Stamm von Interesse unter Verwendung transgener Methoden oder von Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) oder Kollegen. In diesem Fall sind wir mit dem Stamm TH32 (pie-1 :: tbg-1 :: GFP; pie-1 :: GFP :: H2B) ⁵ bis Chromosomen und Zentrosomen als Marker für die Zellteilung zu visualisieren.
2. Generieren Sie eine synchronisierte Bevölkerung mit einem der drei Methoden: 1) zerfallen gravid Erwachsenen in Hypochloritlösung und verwenden restlichen Embryonen ^6, 2) holen gravid Erwachsenen auf eine gesetzte Platte und laß ihnen lag Embryonen für 1-2 Stunden, oder 3) Pick L4 Larven von einer gemischten Bevölkerung und Umzug in ein neues seeded Platte.
3. Wachsen Nematoden bei 20 ° C bis graviden jungen Erwachsenenalter, die in etwa 96 Stunden aus dem Schlüpfen dauert, 72 h von L1-Larven oder 24 h nach der Häutung L4. Embryonen (2-20 Zellen) in utero enthalten große Blastomeren und Kerne, die optimal für imag sindten sub-zellulären und sub-atomaren Veränderungen sind. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, eine Bevölkerung von jungen Erwachsenen, die eine reichliche Anzahl von frühen Embryonen enthalten generieren.

2. Slide Vorbereitung und Anoxia Chamber Set Up

1. Machen Sie eine feuchte Kammer, vorbereitete Folien, indem Sie ein feuchtes Papiertuch in einem großen Petrischale oder bin mit einem Deckel von ausreichender Größe bedeckt halten.
2. Planen geschmolzene 2% Agarose in entionisiertem H ₂ O durch Erhitzen Mischung in Glaswaren über Mikrowelle oder Wasserbad.
3. Platz 1-3 Tropfen warmen Agarose auf einer sauberen Glasobjektträger. Sofort einen zweiten Schieber senkrecht auf der Agarose Drop (s) invertiert, leicht drücken, so dass die resultierende Pad dünn sein und frei von Luftblasen.
4. Nehmen Sie sich Zeit zu kühlen und langsam auseinander nehmen die beiden Objektträger Verlassen der Agarose Pad intakt auf einer der Folien. Es ist wichtig sicherzustellen, die Agarose-Pad ist dünn genug, um nicht Störe mit der Fähigkeit, das Mikroskop später konzentrieren. Fähigkeit zur Probe visualisieren ist auch abhängig von der spezifischen optischen Abstand des Objektivs im Gebrauch die zwischen Mikroskopen variieren kann.
5. Mit einem sauberen Rasierklinge eine Agarose-Pad in ein kleines Quadrat formen. Bewahren Sie in der vorbereiteten feuchten Kammer bis zum Gebrauch.
6. Sorgfältig unter Verwendung der gleichen sauberen Rasierklinge, nehmen die Kante der Agarose Pad und sie von der Folie auf eine runde 25 mm Mikro Abdeckglases, die Vermeidung der Ansammlung von Luftblasen unter dem Pad. Der runde Deckgläser gewählt zu bedienen passt entsprechend in der microincubator.
7. Einen Tropfen Anästhetikum (0,5% Tricain, 0,05% Tetramisol in M9-Puffer) auf die Agarose Pad zur Verwendung als Anästhetikum. Wählen 5-10 Würmer und Stelle in den Tropfen Anästhetikum. Lassen Sie 1-3 min für Würmer, um die Bewegung zu beenden.
8. Die Begründung für die Beobachtung Embryonen im Uterus erwachsenen, anstatt zerschnitten Embryonen, ist das Potenzial der Embryo desicca minimierention und Bewegung durch die Strömung von Stickstoffgas über den Embryo.
9. Sofort einen Tropfen Halocarbonöl auf der Würmer, die Würmer vor Austrocknung zu verhindern, wie Gas durch die Kammer durchströmt wird. Da die Halocarbonöl ist zähflüssig kann man wählen Sie eine Pipettenspitze oder der Spitze eines Wurms nutzen, um Öl-und Drop auf die Würmer zu sammeln.
10. Sobald der kreisförmigen Deckglas mit den Würmern wartet schlossen die beiden Hälften des Leiden Perfusion microincubator werden getrennt und die Deckgläser wird dann vorsichtig auf die aufrechte Bodenrings angeordnet. Die beiden Seiten der Kammer werden dann geschlossen fest zusammen.
11. Die Kammer wird dann mit dem Stickstoff Gastank über flexible Kunststoffschlauch verbunden und in die entsprechende Stelle auf dem Mikroskoptisch (Abbildung 1C). Zu diesem Zeitpunkt wird der Schlauch und microincubator sollte sorgfältig auf eventuelle Leckagen werden durch eine sichere Befestigung der Schläuche und der Anschluss-Stecker entlang der Seite der Kammer kontrolliert. Eines kann ALso leicht eine geringe Menge Seife Wasser über die Rohrleitung für Luftblasen, die sich bilden, wenn ein Leck vorhanden ist aussehen ausbreiten.

3. Mikroskopie in Anoxia

1. Suchen Tieren bei niedriger Vergrößerung, dann in den entsprechenden höherer Vergrößerung (64x für diese Anwendung) zu Bild Gewebe oder Zellen von Interesse wie embryonale Blastomeren oder Oozyten bei Erwachsenen bewegen. Einschalten des Lasers, um 488 nm GFP-Signal anzuzeigen und zu lokalisieren GFP-Fusionsprotein in der Zelle (n) von Interesse.
2. Um der Verhaftung zu bestimmten Stadium des Zellzyklus visualisieren (zB späten Prophase) identifizieren Blastomeren in früheren Phasen der Zellteilung (zB verspätete Interphase oder frühen Prophase). Zellulären Marker wie Centriol Position Einleitung Chromosomenkondensation, Chromosom Lage und Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Kernhülle wird zur Ermittlung Zellzyklusstadium (Abbildung 2A).
3. Die Kammer wird dann mit Stickstoffgas (99,999% perfundiertN _2; <2 ppm O _2). In diesem Fall haben wir einen Druck von 6 bar zu verwenden, jedoch Druck eventuell angepasst und optimiert werden je nach Größe der einzelnen microincubator und Durchmesser der Schlauch in Gebrauch ist. Weiterhin die Blastomere (en) als der Stickstoff füllt die Kammer, Einstellen der Brennebene nach Bedarf überwachen.
4. An diesem Punkt hat Zeitraffer-Aufnahmen begonnen. Abbildungssystem wird so lange wie notwendig durchgeführt, um interessierende Phänomen erfassen, in diesem Fall Prophase Verhaftung und Andocken von Chromosomen auf der inneren Kernmembran. Die Bilder werden einmal alle 10 sec nicht länger als 30 min genommen. Frequenzen der Bilderfassung und Einstellungen wie Gain und Laserleistung sollte nach Bedarf eingestellt werden.
5. Die Zeit, in welcher die Embryonen zu der anoxischen Umgebung reagieren kann je nach Zellzyklusstadium auf Anoxie Belichtung. Typischerweise Anoxie-induzierten Prophase Festnahme erfolgt innerhalb von 20-30 min zu beginnen Stickstoffgasstrom. Wir haben Anoxie-induzierten Zellzyklusarrest Berufs beobachtetrring in <20 min. Bilder können in diesem Zeitraum erhalten werden, oder bestimmte Bilder können später von einem Zeitraffer-Serie werden. Eine weitere Option ist es, Video-Mikroskopie verwenden, um sub-zellulären Strukturen in Embryonen zu visualisieren.
6. Um eine Wiederherstellung aus der Anoxie-induzierten arretierten Zustand zu dokumentieren, wird das Gas abgeschaltet und die Kammer erlaubt ist, zu Normoxie durch Diffusion wieder während der Aufzeichnung eines Zeitraffer-Serie. Wiederaufnahme der Zellzyklusprogression und Undocking von Chromosomen tritt normalerweise innerhalb von 5-20 min Drehen des Stickstoffgases aus.
7. Beachten Sie, dass in getrennten Experimenten ein Indikator Anoxie, Resazurin, in der Durchflusskammer Mikrokammer platziert wurde, es wurde ermittelt, dass die Kammer anoxischen auf durchschnittlich ca. 19 min wird nach Stickstoffgasstrom wurde gestartet.
8. Bilder und Videos werden unter Verwendung Imaris, Image J oder Photoshop importiert und in QuickTime für die Anzeige.

Ergebnisse

C. elegans Embryonen bei starken Sauerstoffmangel (Anoxie) können durch die Verhaftung biologische Prozesse einschließlich Entwicklung und Zellteilung ⁷ überleben. Die Anoxie induzierte Verhaftung der Zellteilung können überwacht werden, bei einem sub-zellulären Ebene durch Verwendung einer microincubation Kammer in Verbindung mit Stickstoffgas durchströmt und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskops um eine kontrollierte Umgebung, in der Tiere in vivo abgebildet werden kann erst...

Diskussion

Sauerstoffmangel und Suspended Animation

Obgleich das Engagement in schweren Sauerstoffmangel kann tödlich sein für einige Organismen, sind einige Organismen, um die Exposition gegenüber Anoxie überleben. Im Falle von C. elegans, hängt Überleben von Anoxie Belichtung auf Entwicklungsstadium und ist ansprechend auf Anoxie Eintritt in einen Zustand der reversiblen suspendiert Animation in dem eine Anzahl von beobachtbaren biologische Prozesse werden verhaftet. Zellteilung, Entwickl...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenzien / Equipment			Zusammensetzung
Hypochloritlösung			0,7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, um 50 ml zu bringen mit ddH 2 0
M9-Puffer			3 g KH 2 PO 4, 11 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO 4 pro 1 L ddH 2 O
Glasobjektträger	Fisher Scientific	12-550-343	3 "x1" x1.0 mm
Round micro Deckglas	Electron Microscopy Sciences	72223-01	25 mm Durchmesser
Halocarbonöl 700	Sigma	H8898-100ml
Narkose			0,5% tricaine, 0,05% Tetramisol
Leiden Closed Perfusion Microincubator	Harvard Apparatus	650041
UHP Stickstoff	Calgaz (Air Liquide)		> 99,9990% N 2 <2 ppm O 2
Kunststoffschlauch	VWR	89068-468	0,062 "ID x 0,125" OD
Spinning-Disk-konfokale Mikroskop	McBain Systeme		Zeiss invertiert optischen Mikroskop, Epifluoreszenz Beleuchtungssystem, CSU-10 Yokogawa konfokalen Scanner, Hamamatsu-Elektronen-Vervielfacher CCD-Kamera.