Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões

Resumo

Descrito aqui é um In vivo A técnica de sub-imagem estruturas celulares em animais expostos a anoxia usando um fluxo de gás através da câmara microincubation em conjunto com um microscópio confocal de disco giratório. Este método é simples e suficientemente flexível para satisfazer uma variedade de parâmetros experimentais e sistemas modelo.

Resumo

Caenorhabdits elegans tem sido amplamente utilizado no estudo da resistência a fadiga, o que é facilitado pela transparência das fases adultas e de embriões, assim como pela disponibilidade de mutantes genéticos e estirpes transgénicas que expressam uma variedade de proteínas de fusão ^1-4. Além disso, os processos dinâmicos, tais como a divisão celular pode ser visualizado utilizando proteínas repórter fluorescente etiquetado. O estudo da mitose pode ser facilitado através da utilização de experiências de lapso de tempo de vários sistemas, incluindo organismos intactos, assim a C. precoce embrião elegans é bem adequado para este estudo. Apresentado aqui é uma técnica pela qual imagem in vivo de sub-estruturas celulares em resposta a anóxica (99,999% N _2; <2 ppm O ₂₎ o estresse é possível através de um fluxo de gás através de simples instalação em um microscópio de alta potência. A câmara microincubation é usado em conjunto com um fluxo de azoto e de gás através de um microscópio confocal de disco giratóriopara criar um ambiente controlado no qual os animais podem ser visualizados in vivo. Usando GFP-tagged tubulina gama e histona, a dinâmica ea prisão de divisão celular podem ser monitorados antes, durante e após a exposição a um ambiente privado de oxigênio. Os resultados desta técnica são de alta resolução, vídeos e imagens detalhadas das estruturas celulares dentro blastômeros de embriões expostos à privação de oxigênio.

Protocolo

1. Preparação da Amostra

1. Produzir ou obter apropriado transgênico C. elegans estirpe de interesse, utilizando metodologias de transgênicos ou de Caenorhabditis Genética da Center (CGC) ou colega. Neste caso estamos usando tensão TH32 (torta-1 :: TBG-1 :: GFP; torta-1 :: GFP :: H2B) ⁵ para visualizar cromossomos e centrossomas como marcadores para a divisão celular.
2. Gerar uma população sincronizada usando um dos três métodos: 1) se desintegrar adultos grávidas em solução de hipoclorito e usar embriões restantes ^6, 2) escolher adultos grávidas em uma placa sem sementes e deixá-los colocar embriões para 1-2 horas, ou 3) escolher L4 larvas de uma população mista e mudança para um novo prato semeado.
3. Nematóides crescer a 20 ° C a gravid idade adulta jovem, que terá cerca de 96 horas de incubação, 72 horas a partir de larvas L1 ou 24 horas pós muda L4. Embriões (2-20 células) no útero conter blastômeros grandes e núcleos que são ideais para imagalterações profundas sub-celular e sub-nuclear, respectivamente. Esta metodologia proporciona um meio para gerar uma população de adultos jovens que contêm um número abundante de embriões precoces.

2. Preparação de slides e anoxia Câmara Configurar

1. Fazer uma câmara húmida para segurar lâminas preparadas pela colocação de uma toalha de papel húmido no interior de uma caixa de Petri grande ou bin coberto com uma tampa de tamanho suficiente.
2. Prepare fundido agarose a 2% em _H2O desionizada aquecendo mistura em recipientes de vidro por meio de banho de ondas ou água.
3. Coloque gotas 1-3 de agarose quente sobre uma lâmina de vidro limpa microscópio. Colocar imediatamente uma segunda lâmina invertida perpendicularmente por cima da gota de agarose (s), pressione ligeiramente de modo que a almofada resultante será fina e livre de bolhas de ar.
4. Dê tempo para esfriar e, lentamente, desmontar as duas lâminas de microscópio, deixando o bloco de agarose intacto em um dos slides. É importante assegurar a almofada de agarose é suficientemente fino para não interferindore com a capacidade de focar o microscópio depois. Capacidade de visualizar de amostra é também dependente da distância óptica específica do objectivo de utilização, que pode variar entre os microscópios.
5. Use uma lâmina de barbear limpa para moldar almofada de agarose em um pequeno quadrado. Armazenar na câmara preparado úmido até que esteja pronto para uso.
6. Com cuidado, utilizando a mesma lâmina limpa, tomar a borda do bloco de agarose e transferi-lo a partir da corrediça para uma lamela 25 mm de diâmetro, micro, evitando a acumulação de bolhas de ar por baixo da almofada. A lamela rodada selecionado para usar apropriadamente se encaixa no microincubator.
7. Adicionar uma gota de anestésico (0,5% tricaina, tetramisole 0,05% em tampão M9) sobre a almofada de agarose para o uso como um anestésico. Escolha vermes 5-10 e coloque na gota de anestésico. Permitir 1-3 min para vermes para cessar o movimento.
8. O racional para a observação de embriões no útero de adultos, em vez de embriões dissecados, é o de minimizar o potencial de embrião desiccação e de movimento, devido ao fluxo de gás de azoto através do embrião.
9. Imediatamente adicionar uma gota de óleo halocarbono em cima dos vermes para prevenir os vermes de desidratação como o gás flui através da câmara. Uma vez que o óleo é viscoso halocarbono pode-se usar uma ponta de pipeta ou ponta de um verme escolher para recolher o óleo e cair sobre os vermes.
10. Uma vez que a lamela circular contendo as minhocas está pronta, as duas metades do Leiden fechado perfusão microincubator são separadas, e a lamela é então cuidadosamente colocada de pé sobre o anel inferior. Os dois lados da câmara são então fechada hermeticamente em conjunto.
11. A câmara é então ligada ao tanque de gás de azoto através do tubo de plástico flexível e colocado no local adequado na platina do microscópio (Figura 1C). Neste momento, o tubo e microincubator devem ser cuidadosamente verificados para identificar qualquer fuga ao assegurar uma fixação segura do tubo e dos tampões de porta ao longo do lado da câmara. Pode-se altão levemente espalhar uma pequena quantidade de água de sabão ao longo do tubo de olhar para as bolhas, as quais irão formar um vazamento, se estiver presente.

3. Microscopia em Anoxia

1. Localize animais com menor ampliação, então, mudar-se para a ampliação adequada superior (64x para esta aplicação) para o tecido de imagem ou células de interesse, como blastômeros embrionárias ou ovócitos em adultos. Ligar o laser de 488 nm para visualizar o sinal GFP e localizar a proteína GFP na célula (s) de interesse.
2. Para visualizar a prisão na fase específica de parada do ciclo celular (por exemplo, prófase tarde) identificar um blastômero em um estágio antes da divisão celular (interfase tardio, ou prófase). Marcadores celulares, tais como a posição de centríolos, a iniciação da condensação cromossômica, localização cromossoma ea presença ou ausência do envelope nuclear permitirá identificar estágio do ciclo celular (Figura 2A).
3. A câmara é, então, submetido a perfusão com gás azoto (99,999%N _2; <2 ppm de O _2). Neste caso, usamos uma pressão de 6 psi, mas a pressão pode necessitar de ser ajustado e optimizado em função do tamanho de cada microincubator e diâmetro do tubo a ser utilizado. Continuar a monitorizar o blastômero (s) como o azoto enche a câmara, ajustando o plano focal conforme necessário.
4. Neste ponto, o lapso de tempo de imagem tiver começado. Formação de imagens é realizada durante o tempo necessário para capturar fenómeno de interesse, neste caso prisão prófase e acoplagem de cromossomas para a membrana nuclear interna. Imagens são tomadas uma vez a cada 10 segundos por não mais do que 30 minutos. Freqüências de captura de imagem e definições, como ganho e potência do laser deve ser ajustada conforme necessário.
5. O tempo em que os embriões respondem ao ambiente anóxico pode variar dependendo da fase do ciclo celular após exposição anoxia. Tipicamente anóxia induzida prisão prófase ocorre dentro de 20-30 min a partir do fluxo de gás de azoto. Temos observado anóxia induzida por células ocu parada do ciclorring em <20 min. As imagens podem ser obtidas durante este período de tempo, ou imagens específicas pode ser isolado depois de uma série de lapso de tempo. Uma opção adicional é a utilização de microscopia de vídeo para visualização de estruturas sub-celulares em embriões.
6. Para documentar a recuperação do estado de anóxia induzida preso, o gás está desligado ea câmara é permitida para retornar à normóxia por difusão durante a gravação de uma série de lapso de tempo. Reinício da progressão do ciclo celular e desencaixe de cromossomos normalmente ocorre dentro de 5-20 minutos de transformar o gás nitrogênio fora.
7. Note-se que em experiências separadas indicador anoxia, resazurina, foi colocado na microcâmara flow-through, determinou-se que a câmara anóxica torna-se, em média, de cerca de 19 min após o fluxo de gás azoto foi iniciada.
8. Imagens e vídeos são processadas utilizando Imaris, Imagem J ou Photoshop e importados para o QuickTime para exibição.

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Resultados

Embriões C. elegans expostas à privação de oxigênio grave (anoxia) são capazes de sobreviver com a prisão de processos biológicos, incluindo desenvolvimento e divisão celular ^7. A prisão anóxia induzida da divisão celular pode ser monitorizada, a um nível sub-celular, por meio de uma câmara de microincubation em conjunto com um fluxo de azoto e de gás através de um microscópio confocal de disco giratório para criar um ambiente controlado no qual os animais podem ser visualizados

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Discussão

Privação de oxigênio e Suspended Animation

Embora a exposição à privação de oxigênio grave pode ser fatal para alguns organismos, alguns organismos são capazes de sobreviver à exposição a anoxia. No caso de C. elegans, a sobrevivência de exposição anoxia depende estágio de desenvolvimento e de resposta à anoxia é a entrada para um estado de animação suspensa reversível no qual um certo número de processos biológicos observáveis ​​são presos. Processos de d...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentes / Equipamentos			Composição
Solução de hipoclorito			0,7 g de KOH, 12 ml de NaOCl a 5%, levar a 50 ml com DDQ 2 0
Tampão M9			3 g KH 2 PO 4, 11 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml (1 M) MgSO 4 por 1 L DDH 2 O
Lâminas de vidro de microscópio	Fisher Scientific	12-550-343	3 "x1" mm X1.0
Rodada micro lamínula	Electron Microscopy Sciences	72223-01	25 mm de diâmetro
Halocarbon óleo 700	Sigma	H8898-100ml
Anestésico			Tric 0,5%aine, tetramisole 0,05%
Leiden Perfusão Fechado Microincubator	Harvard Apparatus	650041
Nitrogênio UHP	Calgaz (Air Liquide)		> 99,9990% N 2 <2 ppm de O2
Tubos de plástico	VWR	89068-468	0.062 "ID x 0,125" OD
Spinning microscópio confocal de disco	McBain Sistemas		Invertido Zeiss microscópio óptico, o sistema de iluminação de epifluorescência, CSU-10 Yokogawa digitalizador confocal, Hamamatsu multiplicador de electrões de câmara CCD.