小鼠脑皮层星形胶质细胞的分离和培养

摘要

星形胶质细胞被确认为是正常的大脑发育和功能，以及中枢神经系统的修复是必不可少的基本​​生物过程的多功能细胞参与。在这里，我们提出了一个快速的过程，以获得纯净的小鼠星形胶质细胞培养研究本类主要的中枢神经系统的细胞生物学。

摘要

星形胶质细胞是哺乳动物大脑中的细胞类型丰富，但仍有许多工作有待了解它们的分子和功能特性。星形胶质细胞在体外培养系统可以用来详细研究这些神经胶质细胞的生物学功能。此视频协议显示了如何获得纯鼠标幼崽的混合皮层细胞的分离和培养的星形胶质细胞。该方法是基于上没有存活的神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞，小胶质细胞，三个主要的神经胶质细胞种群的中枢神经系统的，在培养和分离。在第一天的文化代表图像显示的混合细胞群的存在，并表示时间点，当星形胶质细胞的汇合和小胶质细胞和少突胶质细胞应分开。此外，我们表现出纯度和完善培养的星形胶质细胞，用免疫细胞化学染色星形胶质细胞形态和新近被描述的星形胶质细胞的标记。这种文化系统可以很容易地获得纯星形胶质细胞和星形胶质细胞条件培养液对星形胶质细胞生物学研究的各个方面。

引言

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的一个非常丰富的细胞类型。在小鼠和大鼠皮质星形胶质细胞对神经元的比例是1:3，而每个神经元有1.4星形胶质细胞在人脑皮层^1。在最近几年急剧增加星形胶质细胞功能的兴趣。一个关键功能的星形胶质细胞是神经元^2,3结构和代谢支持的作用。新发现的星形胶质细胞的作用涵盖了广泛的功能。这些措施包括^4-6在开发过程中，引导轴突和若干神经母细胞的迁移功能的突触传递，突触强度和信息处理的神经回路^7-9，形成血脑屏障（BBB）的角色，在¹⁰和完整性^11-13调节脑血管音^14。的另一大特点是他们的星形胶质细胞对损伤的反应。在病理条件astrocyt的上课成为反应性和进一步上调表达的中间丝胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和抑制细胞外基质（ECM）蛋白^15,16。划定的健康组织的损伤部位形成胶质瘢痕，主要由星形胶质细胞分泌的细胞外基质蛋白，硫酸软骨素蛋白多糖（CSPG）家庭星形胶质细胞反应性增生，抑制轴突再生的主要因素，中枢神经系统损伤后^{15日至17日} 。

星形胶质细胞在胚胎发育晚期和产后早期生命起源于放射状胶质细胞（RG）。规范已发生后，星形胶质细胞，星形胶质细胞的前体迁移到它们的最终位置，在那里他们开始终末分化过程中， 在体内 ，星形胶质细胞似乎是成熟的出生后三至四个星期，如所指示的典型形态^18,19。 RG细胞亚群转化为脑室下区星形胶质细胞（B型细胞）。乙超视距，RG型和B细胞的功能在开发过程中的成人星形胶质细胞的神经干细胞（NS​​Cs）。喜欢的星形胶质细胞，RG和B型细胞也表达星形胶质细胞特异性的谷氨酸转运体（GLAST），脑脂质结合的蛋白（BLBP）的，和GFAP，表明这些标记可以不专门用于专门标记成人星形胶质细胞。相反成人的实质星形胶质细胞，没有分裂的健康的大脑，RG和B型细胞表现出干细胞的潜力，如自我更新的能力。星形胶质细胞失调有牵连的许多病症，包括老年痴呆症的^20,21，亨廷顿氏病^22，帕金森氏病^23，Rett综合征^24日和亚历山大的疾病^25。此外，星形胶质细胞反应所有侮辱的中枢神经系统，导致星形胶质细胞活化和星形胶质细胞胶质瘢痕的形成^16,26。星形胶质细胞胶质瘢痕形成以下大脑TRAUMA或脊髓损伤被认为是主要的屏障，防止神经细胞再生的^15。

可靠的方法来隔离和保持纯化的细胞群的发展一直是我们了解神经系统的关键。创业的工作由麦卡锡和Vellis使调查人员，准备近纯培养的星形胶质细胞从新生大鼠组织^27。关于使用这种方法，在这里稍加修改，以隔离小鼠脑皮层星形胶质细胞星形胶质细胞生物学已学到很多东西。补充体内研究中 ，星形胶质细胞以及空调介质使用所描述的体外培养，是宝贵的工具，以进一步深入了解星形胶质细胞的功能。

研究方案

1。混合皮层细胞的分离和电镀

混合皮层星形胶质细胞培养细胞分离，可以使用P1到P4鼠标幼崽。为了实现适当的星形胶质细胞的密度，它是必要的使用4鼠标小狗皮质每T75组织培养烧瓶中。因此，以下协议中的卷是计算一个单元使用4次鼠标幼崽的准备。

1. 开始解剖过程之前，prewarm 30毫升的星形胶质细胞的培养基（DMEM，高葡萄糖+ 10％热灭活的牛胎儿血清+ 1％青霉素/链霉素;见表）至37℃。涂布一T75烧瓶中，用20毫升的聚-D-赖氨酸（PDL），在1小时，在细胞培养级的水的浓度为50微克/毫升，在37℃下在CO ₂培养箱中。
2. 对于解剖过程中，准备所有必要的试剂和材料。你将需要：手术剪，抚平细小的镊子，平头镊子，纸巾，垃圾袋，70％乙醇D 2解剖菜（3.5厘米直径）冰填充用2 ml HBSS。
3. 轻轻握住，并用70％乙醇的小狗鼠标喷的头部和颈部。被牺牲的动物通过斩首使用的剪刀。
4. 执行正中切口，后到前，，沿头皮透露的头骨。
5. 切头盖骨仔细地从脖子到鼻子。两个额外的削减，以便进一步进入大脑进行：第一刀前部的嗅球，另一种劣质的小脑断开的头盖骨，颅底。
6. 颅翼片使用扁平喷嘴钳，轻轻翻转到侧和大脑被取出并置于第一解剖菜填充用HBSS。将菜上的冰和继续收集所有4个大脑。
7. 在立体显微镜下进行解剖过程的其余部分。首先，在嗅球和小脑使用精细除去解剖钳（ 图1B）。
8. 为了找回皮质，抓住后用细镊子的大脑，执行一个正中切口两半球，镊子插入第二组创建的树林和剥离的板状结构的皮质大脑。
9. 仔细解剖脑膜皮质半球拉用细镊子（ 图1D）。此步骤可避免污染最终的星形胶质细胞的培养由脑膜细胞和成纤维细胞。准备皮质半球转移到第二盘充满了HBSS，并返回到冰。所有4个皮质继续进行。
10. 最后，横切成小块，用锋利的刀片（约4至8倍）的皮质半球。
11. 在无菌条件下，转印的皮质片放入一个50毫升Falcon管中，并添加至总体积为22.5毫升的HBSS中。
12. 加入2.5毫升的2.5％的胰蛋白酶，混合孵育的组织在37℃下在水浴中30分钟。混合偶尔晃动每10分钟。
13. 离心5分钟，在300×g离心沉淀皮层组织片。
14. 仔细收集上清用倾析法。为了避免失去组织沉淀，您可以机械地保留使用吸管。解离成单细胞悬浮液，通过添加10毫升星形胶质细胞电镀介质和剧烈的移液使用10毫升塑料移液管，直到组织片解离成单细胞（20〜30次）的组织。调节音量使用星形胶质细胞电镀液20毫升。您可以证明的皮质组织的离解成单个细胞，用血细胞计数板计数。一个准备的4鼠标小狗的皮质产生10-15×10 ^6个分离的单个细胞。
15. 吸干PDL从T75培养瓶中，板的解离的单细胞悬浮液和孵育在37℃下在CO ₂培养箱中。

2。获取ENRiched星形胶质细胞文化

1. 改变介质的电镀混合皮层细胞和所有的3天之后的2天之后。
2. 7〜8天，当星形胶质细胞的汇合和叠加的小胶质细胞上的星形胶质细胞层坐在暴露或已经脱离的星形胶质细胞层（ 图2）后，摇动的T75烧瓶中，在180rpm下30分钟以除去小胶质细胞上轨道摇床。弃上清含小神经胶质细胞或文化，如果你想和检查小胶质细胞，旋转和文化^28,29板。
3. 添加20毫升新鲜星形胶质细胞的培养基中，并继续通过摇动烧瓶中，在240 rpm下6小时，以除去少突胶质细胞的前体细胞（OPC）。由于一些OPCs的不会完全从星形胶质细胞层分离，的继续用手剧烈振摇1分钟，为了防止OPC污染。弃上清或旋转板，如果你想培养OPCs的^29。
4. 冲洗剩余的confluent的星形胶质细胞层两次，用PBS，吸出PBS，添加5毫升胰蛋白酶-EDTA和孵育在37℃下在CO ₂培养箱中每5分钟检查支队的星形胶质细胞和执行支队的星形胶质细胞的击中烧瓶中对你的手的手掌（2-3倍）。
5. 后星形胶质细胞的分离培养瓶中，加入5毫升的星形胶质细胞的培养液中，自旋细胞在180×g离心5分钟，吸出上清液，加40毫升新鲜的星形胶质细胞的镀介质。一个T75细胞培养瓶中后的第一次细胞分裂产生约1×10 ^6个细胞。板细胞在CO ₂培养箱中在37℃下在两个T75培养瓶中并孵育。更改的介质每2到3天。
6. 12-14天，先拆后星形胶质细胞接种于合适的细胞浓度为24-48小时，然后再进行实验。一个T75细胞培养瓶中应该产生大约1.5-2×10 ^6个细胞后，第二次细胞分裂。

结果

当完整的小鼠脑组织（ 图1A），小脑和嗅球必须要除去（ 图1B）的隔离。小心地取出（ 图1E）的小鼠脑干个别皮层（ 图1D）（图1C）和脑膜皮层剥离。脑膜的是明显的由脑膜动脉系统的和不完整的去除污染由脑膜细胞和成纤维细胞，星形胶质细胞的最终文化结果。

电镀混合皮层细胞悬浮液后，某些星形胶质细胞已经附加到培?...

讨论

这里介绍的方法是基于从啮齿动物新生儿的大脑，于1980年²⁷麦卡锡和德Vellis的原先所描述的星形胶质细胞培养制备。从出生P1到P4小鼠大脑皮质星形胶质细胞的分离和培养的方法，这里介绍的是速度快，产量纯星形胶质细胞是高度可重复性。这种技术可以很容易地转移到隔离来自其他物种的星形胶质细胞，如从大鼠或猪和由大脑的其他区域，如脊髓。而由麦卡锡和deVellis的方法，从新生儿?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
工作解决方案的名称	公司	目录编号	终浓度
			星形胶质细胞培养基
DMEM，高糖	Life Technologies公司	31966-021
FBS，热灭活	Life Technologies公司	10082-1​​47	终浓度：10％
青霉素 - 链霉素	Life Technologies公司	15140-122	最终浓度：1％
			脑组织掏的解决方案estion
HBSS	Life Technologies公司	14170-088
2.5％胰蛋白酶	Life Technologies公司	15090-046	终浓度为0.25％
			其他
70％（体积/体积）乙醇	罗斯	9065.2
聚-D-赖氨酸	密理博	A-003-E	50微克/毫升
水	PAA	S15-012	细胞培养级
PBS	PAA	H15-002	细胞培养级
0.05％的尝试PSIN-EDTA	Life Technologies公司	25300-062
0.45微米的无菌过滤器	赛多利斯	16555
3.5厘米培养皿	BD猎鹰	353001
15毫升的Falcon管	BD猎鹰	352096
50毫升Falcon管	BD猎鹰	352070
75平方厘米的组织培养瓶中	BD猎鹰	353136
钳，细	杜蒙	2-1032，2-1033	＃3C＃5
钳，平头	KLS马丁	12-120-11
13厘米的手术剪刀	蛇牌	BC-140-R
体视显微镜	徕卡		MZ7.5
体视显微镜+相机	徕卡		MZ16F; DFC320
显微镜+相机	蔡司，佳能		的普里莫垂直的PowerShot A650 IS
离心分离	Eppendorf公司	5805000.017	Centrifuge5804R
轨道振动筛	Thermo Scientific的	SHKE 4450-1CE	MAXQ 4450
水浴	JULABO		小号W20 37°C;