Isolation und Kultur von Maus Kortikale Astrozyten

Zusammenfassung

Astrozyten wurden erkannt, vielseitige beteiligten Zellen in grundlegender biologischer Prozesse, die wichtig für die normale Entwicklung des Gehirns und Funktion, und das zentrale Nervensystem Reparatur sein. Hier präsentieren wir ein schnelles Verfahren zur reinen Maus Astrozytenkulturen erhalten, um die Biologie dieser wichtigen Klasse von zentralen Nervensystems Zellen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Astrozyten sind eine reiche Zelltyp im Gehirn von Säugetieren, aber es bleibt noch viel über ihre molekularen und funktionellen Eigenschaften erlernt werden. In vitro Astrozyten Zellkultur-Systeme können verwendet werden, um die biologischen Funktionen dieser Gliazellen im Detail zu studieren. Dieses Video-Protokoll zeigt, wie reine Astrozyten durch Isolierung und Kultivierung von gemischten kortikalen Zellen der Maus Welpen zu erhalten. Die Methode basiert auf der Abwesenheit von lebensfähigen Neuronen und der Trennung von Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia, die drei wichtigsten glialen Zellpopulationen des zentralen Nervensystems, in Kultur. Repräsentative Bilder in den ersten Tagen der Kultur zeigen die Gegenwart einer gemischten Zellpopulation, und zeigen den Zeitpunkt, wann Astrozyten konfluent werden und sollte von Mikroglia und Oligodendrozyten getrennt werden. Darüber hinaus zeigen wir, Reinheit und astrozytären Morphologie der Astrozyten mit immunzytochemische Färbungen für gut etabliert undneu beschriebenen Astrozyten Marker. Diese Kultur kann leicht verwendet werden, um reine Maus Astrozyten und Astrozyten-konditioniertem Medium zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Astrozyten Biologie erhalten.

Einleitung

Astrozyten sind eine sehr reichliche Zelltyp im zentralen Nervensystem (ZNS). Das Verhältnis von Astrozyten mit Neuronen ist 1:3 im Cortex von Mäusen und Ratten, während es 1,4 Astrozyten pro Neuron im menschlichen Hirnrinde ¹ sind. Das Interesse an Astrozytenfunktion hat sich in den letzten Jahren zugenommen. Eine wichtige Funktion der Astrozyten ist ihre Rolle bei der Bereitstellung von strukturellen und metabolischen Unterstützung Neuronen ^2,3. Neu entdeckte Rollen für Astrozyten decken ein breites Spektrum von Funktionen. Dazu gehören Führen des Migration von Axonen und die Entwicklung bestimmter Neuroblasten während der Entwicklung ^4-6, Bildung Funktionen im synaptischen Übertragung, Synapse Festigkeit und Informationsverarbeitung durch neuronalen Schaltkreise ^7-9, Rollen in Blut-Hirn-Schranke (BBB) ^​​10 und Integrität ^11-13 und Regulierung des zerebrovaskulären Ton ^14. Ein weiteres wichtiges Merkmal der Astrozyten ist ihre Reaktion auf eine Verletzung. Unter pathologischen Bedingungen astrocytes reaktiv werden und ferner hochregulieren die Expression des Intermediärfilament gliales fibrilläres saures Protein (GFAP) und inhibitorische extrazellulären Matrix (ECM)-Proteine ^​​15,16. Reaktiven Astrozyten Abgrenzung der verletzten Stelle aus gesundem Gewebe durch Bildung einer glialen Narbe, die hauptsächlich aus Astrozyten sezernierten ECM Proteine ​​des Chondroitinsulfat-Proteoglykan (CSPG) Familie, hemmen die wichtigsten Faktoren, die axonale Regeneration nach ZNS-Verletzung ^15-17.

Astrozyten stammen aus radialen Gliazellen (RG)-Zellen während der späten Embryogenese und der frühen postnatalen Leben. Nach Spezifikation Astrozyten aufgetreten ist, Astrozyten Vorstufen ihren Endpositionen zu migrieren, wo sie den Prozess der terminalen Differenzierung beginnen. In vivo erscheinen Astrozyten als drei bis vier Wochen nach der Geburt, wie durch ihre reife typische Morphologie ^18,19 angedeutet. Eine Subpopulation von RG Zellen wandeln in Subventrikulärzone Astrozyten (Typ B-Zellen). Both, RG und Typ B-Zellen funktionieren wie Astrozyten-wie neurale Stammzellen (NSCs) während der Entwicklung und in der erwachsenen sind. Wie Astrozyten, RG und Typ B-Zellen exprimieren auch den Astrozyten-spezifischen Glutamat-Transporter (GLAST), Hirn Lipid-bindendes Protein (BLBP) und GFAP, was anzeigt, dass diese Marker nicht ausschließlich verwendet werden, um spezifisch zu markieren erwachsenen Astrozyten. Im Gegensatz zu erwachsenen parenchymatösen Astrozyten, die nicht im gesunden Gehirn, RG und Typ B-Zellen zeigen Stammzellpotenzial wie die Fähigkeit sich selbst zu erneuern müssen teilen. Fehlregulation von Astrozyten wurden in zahlreichen Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich Alzheimer-Krankheit ^20,21, Chorea Huntington ^22, Parkinson-Krankheit ^{23, 24} Rett-Syndrom und Alexander-Krankheit ^25. Zudem reagieren Astrozyten für alle Beleidigungen des ZNS, die zu Astrozyten-Aktivierung und Astrozyten Gliazellen Narbenbildung ^16,26. Die Astrozyten Glianarbe die folgenden Gehirn tr bildetauma oder Rückenmarksverletzung wird angenommen, dass die wichtigste Barriere gegen neuronale Regeneration ¹⁵ sein.

Die Entwicklung von zuverlässigen Methoden zu isolieren und zu erhalten gereinigten Populationen von Zellen war wesentlich für das Verständnis des Nervensystems. Bahnbrechende Arbeiten von McCarthy und de Vellis können Ermittler bislang fast reine Kulturen von Astrozyten aus neugeborenen Ratten Gewebes ²⁷ vorzubereiten. Viel ist über Astrozyten Biologie mit dieser Methode, die hier in einer leicht modifizierten Form zur Isolierung Maus kortikalen Astrozyten präsentiert gelernt. Ergänzend in vivo Studien, Astrozyten als auch konditioniertem Medium unter Verwendung der in vitro-Kultur beschrieben werden, sind wertvolle Werkzeuge, um weitere Einblicke in Astrozyten Funktionen.

Protokoll

Ein. Isolierung und Beschichtung von Mixed kortikalen Zellen

Mixed kortikalen Zellen Isolierung für Astrozytenkulturen kann mit P1 bis P4 Maus Welpen werden. Um eine ordnungsgemäße Astrozyten Dichte zu erreichen ist es notwendig, 4 Maus pup Kortex pro T75 Zellkulturflasche verwenden. Daher werden in der folgenden Volumina Protokoll für ein Zellpräparat unter Verwendung von 4 Maus Jungtieren berechnet.

1. Vor Beginn des Verfahrens Dissektion, vorwärmen 30 ml Astrozyten Kulturmedien (DMEM, hohe Glucose + 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum + 1% Penicillin / Streptomycin; siehe Tabelle) bis 37 ° C Mantel ein T75-Flasche mit 20 ml Poly-D-Lysin (PDL) in einer Konzentration von 50 pg / ml in der Zellkultur-Wasser für 1 Stunde bei 37 ° C im CO _2-Inkubator.
2. Für die Dissektion Verfahren, bereiten alle notwendigen Reagenzien und Materialien. Sie benötigen: chirurgische Schere, glatte feinen Pinzette, flache Spitze Pinzette, Papierhandtücher, Abfallbeutel, 70% Ethanol eind 2 Sezieren Gerichten (3,5 cm Durchmesser) auf Eis mit 2 ml HBSS jeweils gefüllt.
3. Sanft halten und sprühen Sie den Kopf und Hals der Maus Welpen mit 70% Ethanol. Das Tier wird durch Enthauptung mit der Schere geopfert.
4. Führen Sie einen Medianschnitt, von hinten nach vorne, entlang der Kopfhaut, um den Schädel zu offenbaren.
5. Schneiden Sie den Schädel vorsichtig aus dem Hals bis zur Nase. Zwei weitere Schnitte werden durchgeführt, um einen weiteren Zugriff auf das Gehirn zu ermöglichen: Der erste Schnitt erfolgt anterioren der Riechkolben, der andere inferior des Kleinhirns, um den Schädel von der Schädelbasis trennen.
6. Verwendung der flachen Spitze Pinzette sind die kraniale Klappen leicht zur Seite gekippt und das Gehirn erfolgt und in die erste Schale mit HBSS Sezieren gefüllt genommen platziert. Die Schale wieder auf Eis und weiter ernten Alle 4 Gehirne.
7. Der Rest des Verfahrens ist Dissektion unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Zunächst werden die Riechkolben und das Kleinhirn entfernt mit den feinenPinzette (Abbildung 1B).
8. Um die cortices abzurufen, greifen die hinteren Ende des Gehirns mit den feinen Pinzette, führen Sie eine Inzision zwischen den Hemisphären, legen Sie einen zweiten Satz von Zangen zum erstellten Hain und abziehen das plattenförmige Struktur der Rinde von der Gehirn.
9. Sorgfältig sezieren die Hirnhäute aus den Cortex Hemisphären durch Ziehen mit der feinen Pinzette (Abbildung 1D). Dieser Schritt vermeidet Kontaminationen des endgültigen Astrozyten Kultur durch meningealen Zellen und Fibroblasten. Übertragen Sie die vorbereiteten Cortex Hemisphären in die zweite Schüssel mit HBSS gefüllt und schicken Sie es auf Eis. Weiter dementsprechend mit allen 4 Rinden.
10. Schließlich schneiden jedes Cortex Hemisphäre in kleine Stücke mit scharfen Klingen (etwa 4 bis 8 Mal).
11. Unter sterilen Bedingungen Transfer Cortex Stück in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen und fügen HBSS auf ein Gesamtvolumen von 22,5 ml.
12. 2,5 ml 2,5% Trypsin, Mischung und inkubierendas Gewebe im Wasserbad bei 37 ° C für 30 min. Mix von gelegentlichem Schütteln alle 10 min.
13. Zentrifuge 5 min bei 300 xg zu pelletieren Cortex Gewebestücke.
14. Sorgfältig Überstand zu entfernen durch Dekantieren. Um zu vermeiden, verlieren das Gewebe Pellet Sie können mechanisch bewahren Sie sie mit einer Pipette. Dissoziation des Gewebes in einer einzigen Zelle Suspension durch Zugabe von 10 ml Astrozyten Plattierungsmedium und kräftig Pipettieren mit einem 10 ml Kunststoff-Pipette bis Gewebestücke dissoziiert in einzelne Zellen (20 bis 30 mal) sind. Lautstärke auf 20 ml mit Astrozyten Plattierungsmedium. Sie können Nachweis der Dissoziation des Kortex Gewebe in einzelnen Zellen durch Zählen mit einer Zählkammer. Eine Herstellung von 4-Maus pup Kortex sollte zu 10-15 x10 ⁶ dissoziierten Einzelzellen.
15. Absaugen PDL aus dem T75 Kulturflasche, Platte die dissoziierte einzigen Zellsuspension und bei 37 ° C im CO _2-Inkubator.

2. Der Erhalt eines Enriched Astrocyte Kultur

1. Ändern Sie die Medium 2 Tage nach dem Ausplattieren der gemischten kortikalen Zellen und alle 3 Tage danach.
2. Nach 7 bis 8 Tagen, wenn Astrozyten konfluent und Überlagerung Mikroglia sind sitzen exponiert auf der Astrozyten Schicht oder sind bereits aus der Astrozyten Schicht (Abbildung 2) lösen, schütteln Sie die T75 Kolben bei 180 rpm für 30 min auf einem Schüttler um Mikroglia zu entfernen. Überstand verwerfen, die Mikroglia oder wenn Sie zu Kultur und möchten prüfen, Mikroglia, drehen Sie es nach unten und Platte für Kultur ^28,29.
3. 20 ml frisches Astrozyten Kulturmedium und weiter durch Schütteln der Kolben bei 240 rpm für 6 h auf Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) zu entfernen. Da einige OPCs wird nicht vollständig von der Astrozyten Schicht lösen, weiterhin unter kräftigem Schütteln für 1 min, um OPC Kontamination zu verhindern. Überstand verwerfen oder drehen Sie es nach unten und Platte, wenn Sie die Kultur OPCs ²⁹ wollen.
4. Spülen Sie die verbleibenden confluent Astrozyten Schicht zweimal mit PBS absaugen PBS, 5 ml Trypsin-EDTA und Inkubation im CO _2-Inkubator bei 37 ° C. Überprüfen Ablösung der Astrozyten alle 5 min und durchzusetzen Ablösung von Astrozyten durch Anschlagen des Kolbens gegen die Handfläche (2-3 mal).
5. Nach Astrozyten aus der Kulturflasche abgelöst werden, 5 ml Astrozyten Kulturmedium, Spin-Zellen bei 180 xg für 5 min, Überstand entfernen und 40 ml frisches Astrozyten Plattierungsmedium. Eine T75 Zellkulturflasche sollte etwa 1x10 ⁶ Zellen nach der ersten Zelle Split ergeben. Platte Zellen in zwei T75 Kulturflaschen und bei 37 ° C im CO _2-Inkubator. Anderer das Medium alle 2 bis 3 Tage.
6. 12-14 Tage nach der ersten Spaltung Astrozyten sind in der entsprechenden Zelle Konzentration 24-48 h vor Durchführung des Experiments überzogen. Eine T75 Zellkulturflasche sollte etwa 1,5-2 x10 ⁶ Zellen nach der zweiten Zelle Split ergeben.

Ergebnisse

Nach Isolierung des gesamten Gehirn der Maus (Abbildung 1A), das Kleinhirn und die Riechkolben müssen entfernt (Abbildung 1B) werden. Die Rinden werden mit der Maus Hirnstamm (1C) und der Hirnhäute der einzelnen Kortex (1D) geschält werden sorgfältig entfernt (1E). Hirnhäute sind offensichtlich durch die meningea und unvollständige Entfernung führt zur Verunreinigung der endgültigen Astrozyten Kultur meningealen Zellen und Fibro...

Diskussion

Die beschriebene Methode ist hier auf der Astrozyten Kultur Zubereitung von Nagetieren neonatalen Gehirn, die ursprünglich von McCarthy und de Vellis in 1980 ²⁷ beschrieben ist. Die modifizierte Methode der Isolierung und Kultivierung von kortikalen Astrozyten aus postnatalen P1 bis P4 Maushirn hier vorgestellten ist schnell, liefert reines primären Astrozyten und ist hoch reproduzierbar. Diese Technik kann leicht übertragen Astrozyten aus anderen Spezies, wie zB von Ratte oder Schwein und von anderen Hirn...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name der Arbeitslösung	Firma	Katalog-Nummer	Endkonzentration
			Astrocyte Kulturmedien
DMEM, high glucose	Life Technologies	31966-021
FBS, hitzeinaktiviertes	Life Technologies	10082-147	Endkonzentration: 10%
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122	Endkonzentration: 1%
			Lösung für Hirngewebe digestion
HBSS	Life Technologies	14170-088
2,5% Trypsin	Life Technologies	15090-046	Endkonzentration: 0,25%
			Andere
70% (Vol / Vol) Ethanol	Roth	9065,2
Poly-D-Lysin	Millipore	A-003-E	50 ug / ml
Wasser	PAA	S15-012	Zellkultur
PBS	PAA	H15-002	Zellkultur
0,05% Versuchenpsin-EDTA	Life Technologies	25300-062
0,45 um Sterilfilter	Sartorius	16555
3,5 cm Petrischale	BD Falcon	353001
15 ml-Falcon-Röhrchen	BD Falcon	352096
50 ml-Falcon-Röhrchen	BD Falcon	352070
75 cm 2 Zellkulturflasche	BD Falcon	353136
Pinzette, feine	Dumont	2-1032; 2-1033	# 3c; # 5
Pinzette, flache Spitze	KLS Martin	12-120-11
13 cm chirurgische Scheren	Aesculap	BC-140-R
Stereomikroskop	Leica		MZ7.5
Stereomikroskop + Kamera	Leica		MZ16F; DFC320
Microscope + Kamera	Zeiss, Canon		Primo Vert; PowerShot A650 IS
Zentrifugieren	Eppendorf	5805000.017	Centrifuge5804R
Orbitalschüttler	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Wasserbad	Julabo		SW20, 37 ° C