Isolement et culture des astrocytes corticaux de souris

Résumé

Les astrocytes ont été reconnus pour être des cellules polyvalentes qui participent au processus biologiques fondamentaux qui sont essentiels pour le développement normal du cerveau et la fonction, et réparation du système nerveux central. Nous présentons ici une procédure rapide afin d'obtenir des cultures pures astrocytes de souris pour étudier la biologie de cette classe importante de cellules du système nerveux central.

Résumé

Les astrocytes sont un type de cellule abondant dans le cerveau des mammifères, mais il reste beaucoup à apprendre sur leurs caractéristiques moléculaires et fonctionnelles. Astrocytes in vitro systèmes de culture cellulaire peut être utilisé pour étudier les fonctions biologiques de ces cellules gliales dans le détail. Ce protocole vidéo montre comment obtenir les astrocytes pures par l'isolement et la culture des cellules corticales mixtes de souriceaux. La méthode est basée sur l'absence de neurones viables et la séparation des astrocytes, les oligodendrocytes et les microglies, les trois principales populations de cellules gliales du système nerveux central, de la culture. Images représentatifs au cours des premiers jours de culture en évidence la présence d'une population cellulaire mixte et indiquer le point temporel, lorsque les astrocytes deviennent confluentes et ne doit être séparé de la microglie et les oligodendrocytes. De plus, nous démontrons la pureté et de la morphologie des astrocytes astrocytes en culture en utilisant des colorations immunocytochimiques pour bien établies etnouvellement décrit marqueurs astrocytaires. Ce système de culture peut être facilement utilisé pour obtenir des astrocytes de souris pures et astrocytes conditionné moyen pour étudier divers aspects de la biologie des astrocytes.

Introduction

Les astrocytes sont un type cellulaire très abondante dans le système nerveux central (SNC). Le ratio des astrocytes aux neurones est de 1:3 dans le cortex des souris et des rats, alors il ya 1,4 astrocytes par neurone dans le cortex humain ^1. L'intérêt pour la fonction des astrocytes a augmenté de façon spectaculaire ces dernières années. Une des principales fonctions des astrocytes est leur rôle dans le soutien structural et métabolique des neurones ^2,3. Rôles récemment découverts pour astrocytes couvrent un large éventail de fonctions. Il s'agit notamment de guidage de la migration des axones et des neuroblastes développement au cours du développement de certaines ^4-6, fonctions de la transmission synaptique, la force des synapses et de traitement d'informations par des circuits neuronaux ^7-9, les rôles de barrière hémato-encéphalique (BHE) formation ¹⁰ et ^11-13 intégrité et la réglementation des ¹⁴ tonus cérébrovasculaire. Une autre caractéristique importante des astrocytes est leur réponse à une blessure. Sous astrocyt conditions pathologiqueses devenue plus réactive et augmentent l'expression de la protéine intermédiaire filament gliale fibrillaire acide (GFAP) et inhibiteurs de la matrice extracellulaire (ECM) ^15,16 protéines. Astrocytes réactifs délimiter le site de la lésion des tissus sains en formant une cicatrice gliale, qui se compose principalement d'astrocytes protéines de la MEC sécrétées de la chondroïtine sulfate protéoglycanes (GCEP) de la famille, les principaux facteurs qui inhibent la régénération axonale après une lésion du SNC ^15-17.

Les astrocytes proviennent gliales radiales (RG), les cellules lors de l'embryogenèse fin et au début de la vie postnatale. Après la spécification des astrocytes a eu lieu, précurseurs astrocytaires migrer vers leurs positions finales, où ils commencent le processus de différenciation terminale. In vivo, les astrocytes semblent être mature trois à quatre semaines après la naissance, comme indiqué par leur morphologie typique ^18,19. Une sous-population de cellules RG convertir en zone sous-ventriculaire (astrocytes de type cellules B). Both, RG et les cellules de type B fonctionnent comme des astrocytes de type cellules souches neurales (NSC) au cours du développement et chez l'adulte, respectivement. Comme les astrocytes, cellules RG et de type B expriment également le transporteur du glutamate astrocytes spécifique (GLAST), le cerveau des lipides-binding protein (BLBP), et de la GFAP, ce qui indique que ces marqueurs ne peuvent pas être exclusivement utilisé pour marquer spécifiquement les astrocytes adultes. Contrairement aux adultes, les astrocytes parenchymateux, qui ne se divisent pas dans le cerveau, RG sain et cellules de type B présentent un potentiel de cellules souches telles que la capacité d'auto-renouvellement. Le dérèglement des astrocytes a été impliquée dans de nombreuses pathologies, y compris la maladie d'Alzheimer ^20,21, la maladie de Huntington ^22, la maladie de Parkinson ^23, le syndrome de Rett ²⁴ et la maladie d'Alexander ^25. Par ailleurs, les astrocytes réagir à toutes les injures du système nerveux central, conduisant à l'activation des astrocytes et astrocytaire formation cicatrice gliale ^16,26. La cicatrice gliale astrocytaire qui forme tr cerveau suivantelésions de la moelle épinière ou auma est considéré comme le principal obstacle empêchant la régénération neuronale ^15.

Le développement de méthodes fiables d'isoler et de maintenir des populations purifiées de cellules a été essentielle à notre compréhension du système nerveux. Travaux pionniers de McCarthy et de Vellis permet aux enquêteurs à ce jour pour préparer des cultures d'astrocytes presque purs de tissu de rat nouveau-né ^27. On a beaucoup appris sur la biologie des astrocytes en utilisant cette méthode, qui est présentée ici sous une forme légèrement modifiée pour isoler les astrocytes corticaux de souris. En complément des études in vivo, les astrocytes, ainsi que le milieu conditionné obtenu en utilisant le décrit la culture in vitro, sont des outils précieux pour mieux avoir un aperçu des fonctions astrocytes.

Protocole

1. Isolement et placage de Mixed cellules corticales

Mixte isolement des cellules corticales des cultures d'astrocytes peuvent être effectuées à l'aide de P1 à P4 souriceaux. Afin de parvenir à un bon densité des astrocytes, il est nécessaire d'utiliser 4 cortex de souris chiot par T75 flacon de culture tissulaire. Par conséquent, les volumes dans le protocole suivant sont calculés pour une préparation de cellules en utilisant 4 souriceaux.

1. Avant de commencer la procédure de dissection, préchauffer 30 ml de milieu de culture d'astrocytes (DMEM, taux élevé de glucose + 10% de sérum de sérum de veau foetal + 1% de pénicilline / streptomycine; voir tableau) à 37 ° C. Revêtez un flacon T75 avec 20 ml de poly-D-lysine (PDL) à une concentration de 50 pg / ml dans l'eau de culture de cellules de qualité pendant 1 heure à 37 ° C dans l'incubateur CO _2.
2. Pour la procédure de dissection, préparer tous les réactifs et le matériel nécessaires. Vous aurez besoin: ciseaux chirurgicaux, pinces fines lisses, pinces à bout plat, serviettes en papier, sac à déchets, éthanol à 70% d'und 2 plats de dissection (3,5 cm de diamètre) sur la glace remplie de 2 ml de HBSS chacun.
3. Tenir délicatement et pulvériser la tête et du cou de la souris chiot avec de l'éthanol à 70%. L'animal est sacrifié par décapitation à l'aide des ciseaux.
4. Effectuer une incision médiane, arrière en avant, le long du cuir chevelu pour révéler le crâne.
5. Couper le crâne soigneusement à partir du cou vers le nez. Deux coupes supplémentaires sont effectués pour permettre un accès plus vers le cerveau: La première coupe est faite antérieure des bulbes olfactifs, l'autre inférieure du cervelet de débrancher le crâne de la base du crâne.
6. En utilisant la pince à bout plat, les volets crâniens sont doucement basculé sur le côté et le cerveau est prélevé et placé dans le premier plat dissection rempli avec du HBSS. Placer le plat de retour sur la glace et continuer à récolter les 4 cerveaux.
7. Le reste de la procédure de dissection est effectuée sous une loupe binoculaire. Tout d'abord, les bulbes olfactifs et le cervelet sont éliminés en utilisant l'amendePince à dissection (figure 1B).
8. Afin de récupérer les cortex, saisir l'extrémité postérieure du cerveau avec les pinces fines, effectuer une incision médiane entre les deux hémisphères, insérez un second jeu de pinces pour le bosquet créé et décoller la structure en forme de plaque du cortex de la cerveau.
9. Disséquer soigneusement les méninges des hémisphères du cortex en tirant avec une pince fine (figure 1D). Cette étape permet d'éviter la contamination de la culture finale des astrocytes par les cellules méningées et les fibroblastes. Transférez les hémisphères du cortex préparés dans le deuxième plat rempli avec du HBSS et le retourner sur la glace. Continuer en conséquence avec les 4 corticales.
10. Enfin, couper chaque hémisphère du cortex en petits morceaux à l'aide des lames tranchantes (environ 4 à 8 fois).
11. Dans des conditions stériles, des morceaux du cortex transfert dans un tube Falcon de 50 ml et ajouter HBSS pour un volume total de 22,5 ml.
12. Ajouter 2,5 ml de trypsine, mélange 2,5% et incuberle tissu dans le bain d'eau à 37 ° C pendant 30 min. Mélanger en agitant de temps toutes les 10 min.
13. Centrifuger pendant 5 min à 300 xg à granulés de morceaux de tissus de cortex.
14. Retirez délicatement le surnageant par décantation. Afin d'éviter de perdre le culot de tissus vous pouvez retenir mécaniquement à l'aide d'une pipette. Dissocier le tissu dans une suspension cellulaire unique en ajoutant 10 ml Milieu de pipetage astrocytes et vigoureuse à l'aide d'une pipette en plastique 10 ml jusqu'à morceaux de tissu sont dissociées en cellules individuelles (20 à 30 fois). Réglez le volume à 20 ml en utilisant un milieu placage astrocytes. Vous pouvez la preuve de la dissociation des tissus du cortex dans des cellules individuelles en comptant l'aide d'un hématocytomètre. Une préparation de 4 cortex de souris chiot doit rendement de 10-15 x 10 ⁶ cellules dissociées simples.
15. Aspirer PDL du flacon T75 culture, plaque de la suspension de cellules dissociées unique et incuber à 37 ° C dans l'incubateur CO _2.

2. L'obtention d'un Enriched Culture Astrocyte

1. Changer les 2 moyennes jours après l'étalement des cellules corticales mixtes et les 3 jours suivants.
2. Après 7 à 8 jours, alors que les astrocytes sont les microglies confluentes et superposition s'asseoir exposé sur la couche d'astrocytes ou sont déjà détachés de la couche d'astrocytes (figure 2), agiter le flacon T75 à 180 rpm pendant 30 min sur un agitateur orbital pour enlever la microglie. Jeter le surnageant contenant la microglie ou si vous souhaitez à la culture et à examiner les microglies, il ralentit ou plaque de culture ^28,29.
3. Ajouter 20 ml de milieu de culture frais astrocytes et continuer en agitant à 240 tours par minute pendant 6 heures pour éliminer les cellules précurseurs d'oligodendrocytes (OPC). Étant donné que certains pays producteurs de pétrole ne sera pas complètement se détacher de la couche d'astrocytes, continuer à agiter vigoureusement à la main pendant 1 minute afin d'éviter la contamination OPC. Jeter le surnageant ou le tourner vers le bas et plat, si vous le souhaitez à la culture OPC ^29.
4. Rincez le reste confluent couche d'astrocytes deux fois avec du PBS, aspirer le PBS, ajouter 5 ml de trypsine-EDTA et incuber dans l'incubateur CO ₂ à 37 ° C. Vérifiez détachement des astrocytes toutes les 5 min et appliquer détachement des astrocytes en frappant le ballon dans la paume de votre main (2-3 fois).
5. Après astrocytes sont détachées du flacon de culture, ajouter 5 ml de milieu de culture des astrocytes, cellules de spin à 180 xg pendant 5 minutes, aspirer le surnageant et ajouter 40 ml de milieu frais placage astrocytes. Un flacon de culture tissulaire T75 devrait produire environ 1x10 ⁶ cellules après la scission première cellule. Cellules de la plaque dans deux flacons T75 culture et incuber à 37 ° C dans l'incubateur CO _2. Changer le milieu tous les 2 à 3 jours.
6. 12-14 jours après les astrocytes première division sont étalées dans la concentration cellulaire appropriée 24-48 heures avant de réaliser l'expérience. Un flacon de culture tissulaire T75 devrait produire environ 1,5 à 2 x 10 ⁶ cellules après la scission deuxième cellule.

Résultats

Après isolement du cerveau de la souris complète (figure 1A), le cervelet et des bulbes olfactifs doivent être éliminés (figure 1B). Les cortex sont pelées de la tige de cerveau de souris (figure 1C) et les méninges du cortex individuel (figure 1D ») sont soigneusement retirés (figure 1E). Méninges sont évidents par le système de l'artère méningée et les résultats élimination incomplète de la contamination de la cu...

Discussion

La méthode décrite ici est basée sur la préparation des cultures d'astrocytes à partir de cerveaux de rongeurs nouveau-nés, initialement décrite par McCarthy et de Vellis en 1980 ^27. La méthode modifiée de l'isolement et la culture des astrocytes corticaux de P1 à P4 postnatal du cerveau de souris présentée ici est rapide, rendements pures astrocytes primaires et est hautement reproductible. Cette technique peut facilement être transférée à isoler les astrocytes à partir d'autres ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de la solution de travail	Entreprise	Numéro de catalogue	La concentration finale
			Milieux de culture d'astrocytes
DMEM, glycémie élevée	Life Technologies	31966-021
FBS, inactivé à la chaleur	Life Technologies	10082-147	Concentration finale: 10%
Pénicilline-streptomycine	Life Technologies	15140-122	Concentration finale: 1%
			Solution pour creuser le tissu cérébralestion
HBSS	Life Technologies	14170-088
La trypsine 2,5%	Life Technologies	15090-046	Concentration finale: 0,25%
			Autre
70% (volume / volume) d'éthanol	Roth	9065.2
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E	50 pg / ml
Eau	AAP	S15-012	de qualité culture cellulaire
PBS	AAP	H15-002	de qualité culture cellulaire
Essayez de 0,05%PSIN-EDTA	Life Technologies	25300-062
Filtre de 0,45 um stérile	Sartorius	16555
3,5 cm boîte de Pétri	BD Falcon	353001
Falcon de 15 ml Tube	BD Falcon	352096
Falcon de 50 ml Tube	BD Falcon	352070
75 cm 2 flacon de culture tissulaire	BD Falcon	353136
Forceps, bien	Dumont	2-1032, 2-1033	# 3c; # 5
Forceps, embout plat	KLS Martin	12-120-11
13 cm ciseaux chirurgicaux	Aesculap	BC-140-R
Stéréomicroscope	Leica		MZ7.5
Stéréomicroscope + Caméra	Leica		MZ16F; DFC320
Microscope + Caméra	Zeiss; Canon		Primo Vert; PowerShot A650 IS
Centrifuger	Eppendorf	5805000.017	Centrifuge5804R
Agitateur orbital	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Bain d'eau	Julabo		SW20; 37 ° C