בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

Summary

האסטרוציטים הוכרו כתאים צדדיים המשתתפים בתהליכים ביולוגיים בסיסיים שחיוניים להתפתחות המוח ותפקודו תקין, ותיקון מערכת עצבים מרכזי. כאן אנו מציגים הליך מהיר לקבלת תרבויות astrocyte עכבר טהורות ללמוד ביולוגיה בכיתה זו גדולה של תאים במערכת עצבים מרכזיים.

Abstract

האסטרוציטים הם סוג תא בשפע במוח של היונקים, עדיין נותרים הרבה מה ללמוד על המאפיינים המולקולריים ופונקציונליים שלהם. במערכות סלולריות תרבות astrocyte מבחנה יכול לשמש כדי ללמוד את הפונקציות הביולוגיות של תאי גליה אלה בפירוט. פרוטוקול וידאו זה מראה כיצד להשיג האסטרוציטים טהורים על ידי בידוד והתרבות של תאי קליפת מוח המעורבים של גורי עכברים. השיטה מבוססת על העדר נוירונים קיימא וההפרדה של האסטרוציטים, oligodendrocytes ומיקרוגלים, שלוש האוכלוסיות העיקריות גליה התאים של מערכת העצבים המרכזית, בתרבות. תמונות מייצגות בימים הראשונים של התרבות להדגים את נוכחותה של אוכלוסיית תאים מעורבת ומצביעות timepoint, כאשר האסטרוציטים הופכים confluent וצריך להיות מופרדים מהמיקרוגליאה וoligodendrocytes. יתר על כן, אנו מדגימים טוהר ומורפולוגיה astrocytic של האסטרוציטים תרבית באמצעות stainings immunocytochemical למבוסס היטב ותאר חדש סמני astrocyte. מערכת זו התרבות יכולה לשמש בקלות להשיג האסטרוציטים עכבר טהורים ובינוני astrocyte ממוזג ללימוד היבטים שונים של ביולוגית astrocyte.

Introduction

האסטרוציטים הם סוג תא נפוץ מאוד במערכת העצבים המרכזית (CNS). היחס של האסטרוציטים לנוירונים הוא 1:03 בקליפת המוח של עכברים וחולדות, ואילו יש 1.4 האסטרוציטים לנוירון ^ב1 קליפת אדם. ריבית בתפקוד astrocyte גדלה באופן דרמטי בשנים האחרונות. תפקיד מרכזי של האסטרוציטים הוא תפקידם במתן תמיכה מבנית לנוירונים וטבולים ^2,3. תפקידים חדשים שהתגלו להאסטרוציטים לכסות ספקטרום רחב של פונקציות. אלה כוללים מנחים ההגירה של האקסונים המתפתחים וneuroblasts המסוים במהלך הפיתוח ^4-6, פונקציות בהעברה הסינפטית, כוח סינפסה ועיבוד מידע על ידי מעגלים עצביים ^7-9, תפקידים במחסום דם מוח (BBB) ​​היווצרות ¹⁰ ויושרה ^11-13 ורגולציה של ¹⁴ טון כלי הדם במוח. תכונה בולטת נוספת של האסטרוציטים היא תגובתם לפציעה. תחת תנאי astrocyt פתולוגיes להיות תגובתי ועוד upregulate הביטוי של חלבון ביניים נימת גליה fibrillary חומצי (GFAP) ומטריצת החלבונים תאיים מעכבים (ECM) ^15,16. האסטרוציטים תגובתי לתחום את הפגיעה באתר מהרקמה בריאה על ידי יצירת צלקת גלייה, המורכבת בעיקר מחלבונים מופרשים ECM astrocyte של סולפט כונדרואיטין משפחת גליקן (CSPG), הגורמים העיקריים המעכבים התחדשות axonal לאחר פציעת CNS ^15-17.

האסטרוציטים מקורן תאי גלייה רדיאלי (RG) במהלך התפתחות עוברת מאוחר וחיים לאחר לידה מוקדמים. לאחר מפרט astrocyte התרחש, מבשרי astrocyte להגר למצבם הסופי, שבו הם מתחילים בתהליך של בידול מסוף. בחי, האסטרוציטים להיראות בוגר שלושה עד ארבעה שבועות לאחר לידה כפי שצוינו על ידי המורפולוגיה האופיינית ^18,19. תת אוכלוסיות של תאי RG להמיר לתוך האסטרוציטים אזור subventricular (סוג B תאים). Both, RG ותאים מסוג B לתפקד כתאי astrocyte דמוי גזע עצביים (NSCs) במהלך התפתחות ובמבוגרים, בהתאמה. כמו האסטרוציטים, RG ותאים מסוג B גם להביע טרנספורטר astrocyte הספציפי גלוטמט (GLAST), חלבון מוח שומנים מחייבים (BLBP), וGFAP, המציין כי סמנים אלה לא ניתן להשתמש באופן בלעדי במיוחד כדי לתייג את האסטרוציטים בוגרים. בניגוד להאסטרוציטים parenchymal מבוגרים, שאינם מחלקים במוח, RG הבריא ופוטנציאל הסוג B תאי תערוכת תאי גזע כגון יכולת עצמית לחדש. Dysregulation של האסטרוציטים היה מעורב בפתולוגיות רבות, כולל מחלת אלצהיימר ^20,21, מחלת הנטינגטון ^22, מחלת פרקינסון ^{23, 24} רט התסמונת ומחלתו של אלכסנדר ^25. יתר על כן, האסטרוציטים להגיב לכל העלבונות של מערכת העצבים המרכזיים, מה שמוביל להפעלת astrocyte והיווצרות צלקת גלייה astrocytic ^16,26. צלקת גלייה astrocytic שיוצרת מוח tr הבאפגיעה בחוט שדרה או auma נחשבת למכשול העיקרי המונע התחדשות תאי עצב ^15.

הפיתוח של שיטות אמינות לבודד ולשמור על אוכלוסיות מטוהרות של תאים היה חיוני להבנה של מערכת העצבים שלנו. עבודתו החלוצית של מקארתי ודה Vellis מאפשרת לחוקרים למועד להכין תרבויות כמעט טהורות של האסטרוציטים מרקמות חולדת יילודי ^27. רב כבר למד על ביולוגית astrocyte שימוש בשיטה זו, המוצגת כאן בצורה שונה מעט לבידוד האסטרוציטים קליפת המוח של עכברים. משלימים במחקרי vivo, האסטרוציטים, כמו גם מדיום מותנה הושג באמצעות תואר בתרבות מבחנה, הם כלים חשובים נוספת להבנה הטובה של פונקציות astrocyte.

Protocol

1. בידוד וציפוי של תאים קליפתיים מעורבים

בידוד תא קליפת מוח מעורב עבור תרבויות astrocyte יכול להתבצע באמצעות P1 עד P4 גורי עכברים. על מנת להשיג צפיפות astrocyte נכונה יש צורך להשתמש 4 קורטקס סיירי עכבר לבקבוק תרבית רקמת T75. לכן, כרכים בפרוטוקול הבא מחושבים להכנת תאים באמצעות 4 גורי עכברים.

1. לפני שתתחיל בהליך הנתיחה, 30 מ"ל של prewarm תקשורת תרבות astrocyte (DMEM, רמת סוכר גבוה + 10% חום מומת עוברי סרום שור + 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ראה טבלה) עד 37 ° C. 1 T75 בקבוק מעייל עם 20 מ"ל של פולי-D-ליזין (PDL) בריכוז של 50 מיקרוגרם / מיליליטר מים בכיתת תרבית תאים ל1 שעות ב 37 ° C בחממת CO _2.
2. להליך הנתיחה, להכין את כל החומרים כימיים וחומרים דרושים. יהיה עליך: מספרי כירורגיות, מלקחיים עדינים חלקים, מלקחי קצוות שטוחים, מגבות נייר, שקית אשפה, 70% אתנולד 2 מנות מבתרות (3.5 סנטימטרי קוטר) על קרח מלא עם 2 HBSS מ"ל כל אחד.
3. עדינות ולרסס את הראש והצוואר של עכבר הגור עם אתנול 70%. החיה מוקרבת על ידי עריפת הראש באמצעות מספריים.
4. לבצע חתך קו אמצע, אחורי לקדמי, יחד הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
5. חותך את הגולגולת בזהירות מהצוואר אל האף. שני חתכים נוספים מבוצעים על מנת לאפשר גישה נוספת למוח: החתך הראשון הוא עשה קדמי של נורות חוש הריח, 1 הנח של המוח הקטן לנתק את הגולגולת מבסיס הגולגולת האחרת.
6. שימוש במלקחי הקצוות השטוחים, דשי גולגולתם בעדינות התהפכו לצד והמוח נלקח החוצה והניח למנה הראשונה מלאה עם ביתור HBSS. הנח את הצלחת חזרה על קרח ולהמשיך לקצור את כל 4 המוחין.
7. שאר הליך הנתיחה מתבצע תחת מיקרוסקופ סטראוסקופי. ראשית, את נורות חוש הריח והמוח הקטן מוסרות באמצעות הקנסמלקחיים מבתרים (1B איור).
8. כדי לאחזר את קליפת המוח, לתפוס את הקצה האחורי של המוח עם מלקחיים העדינים, לבצע חתך קו אמצע בין שני חצאים המוח, להוסיף סט שני של מלקחיים לחורשה שנוצרה ולקלף את המבנה דמוי צלחת של קליפה מ מוח.
9. זהירות לנתח את קרומי המוח מחצי הקליפה על ידי משיכה עם מלקחיים העדינים (1D איור '). צעד זה ימנע זיהום של תרבות astrocyte הסופית על ידי תאים ופיברובלסטים meningeal. העבר את ההמיספרות קליפה המוכנות למנה השנייה, מלאה HBSS ולהחזיר אותו על גבי קרח. המשך בהתאם עם כל 4 הקורטקס.
10. לבסוף, חותך כל חצי קליפה לחתיכות קטנות באמצעות להבים חדים (כ 4-8 פעמים).
11. בתנאים סטריליים, חתיכות קליפה להעברת צינור אחד 50 מ"ל פלקון ולהוסיף HBSS להיקף כולל של 22.5 מ"ל.
12. הוסף 2.5 מ"ל של טריפסין 2.5%, לערבב ודגירההרקמה באמבט המים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לערבב מדי פעם על ידי מטלטל כל 10 דקות.
13. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 XG לחתיכות רקמת קליפת גלולה.
14. מוציא בזהירות את supernatant ידי decantation. על מנת להימנע מאיבוד רקמת הגלולה שמכאנית עשויים לשמר אותו באמצעות pipet. לנתק את הרקמות לתוך השעית תא בודדה על ידי הוספת מדיום 10 מ"ל astrocyte ציפוי והנמרץ pipetting באמצעות פיפטה פלסטיק 10 מ"ל עד פיסות רקמה הן ניתקו לתוך תאים בודדים (20 עד 30 פעמים). התאם נפח 20 מ"ל באמצעות מדיום הציפוי astrocyte. אתה יכול הוכחת הניתוק של רקמת קליפת המוח לתאים בודדים על ידי ספירה באמצעות hematocytometer. הכנה אחד 4 קורטקס סיירי עכבר אמורה להניב 10-15 x10 ⁶ תאים בודדים ניתקו.
15. PDL לשאוב מבקבוקון התרבות T75, צלחת השעיה ניתקה התא הבודדה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממת CO _2.

2. קבלת Enrתרבות astrocyte iched

1. שנה את 2 ימים הבינוניים לאחר ציפוי של תאים המעורבים של קליפת המוח וכל 3 ימים לאחר מכן.
2. לאחר 7 עד 8 ​​ימים, כאשר האסטרוציטים המיקרוגליאה confluent כיסה לשבת נחשפו בשכבת astrocyte או שהם כבר מנותקים משכבת ​​astrocyte (איור 2), לנער את בקבוק T75 ב 180 סל"ד למשך 30 דקות בהקפה ייקרה להסיר המיקרוגליאה. השלך המיקרוגליאה המכילה supernatant או אם תרצה לתרבות ולבחון מיקרוגליאה, לסובב אותו וצלחת לתרבות ^28,29.
3. הוסף 20 מ"ל הבינוני טריה astrocyte תרבות ולהמשיך בניעור הבקבוק ב 240 סל"ד עבור 6 שעות כדי להסיר תאים מבשרים oligodendrocyte (OPC). מאחר שחלק מOPCs לא להתנתק לגמרי משכבת ​​astrocyte, תמשיך ללחוץ נמרצות ביד במשך דקות 1 כדי למנוע זיהום OPC. בטל supernatant או לסובב אותו כלפי מטה וצלחת, אם אתה רוצה תרבות OPCs ^29.
4. שטוף את conflue שנותרשכבת astrocyte nt פעמים עם PBS, לשאוב PBS, מוסיף 5 מ"ל טריפסין-EDTA ולדגור בCO ₂ החממה ב 37 ° C. בדקו ניתוק של האסטרוציטים כל 5 דקות ולאכוף ניתוק של האסטרוציטים על ידי להכות את הבקבוק על כף היד שלך (2-3 פעמים).
5. לאחר האסטרוציטים מנותקים מבקבוקון התרבות, מוסיף 5 מ"ל של מדיום התרבות astrocyte, תאי ספין ב 180 XG למשך 5 דקות, לשאוב supernatant ולהוסיף 40 מ"ל בינוני טריה astrocyte ציפוי. בקבוקון תרבות אחת T75 רקמה אמור להניב כ 1x10 ⁶ תאים לאחר פיצול התא הראשון. תאי פלייט בשתי T75 צלוחיות תרבות ולדגור על 37 ° C בחממת CO _2. שינוי הבינוני כל 2 עד 3 ימים.
6. 12-14 ימים לאחר את האסטרוציטים המפוצלים 1 מצופים ב24-48 שעתי ריכוז התא המתאימות לפני ביצוע הניסוי. בקבוקון תרבות אחת T75 רקמה אמור להניב כ 1.5-2 ⁶ תאי X10 לאחר פיצול התא השני.

תוצאות

על הבידוד של מוח העכבר השלם (איור 1 א), המוח הקטן ואת נורות חוש הריח יש להסיר (1B איור). הקורטקס הם קלפו של גזע מוח העכבר (התרשים 1C) וקרומים של קליפת הפרט (1D איור ') הם הוציאו בזהירות (האיור 1E). קרום המוח הוא ברור על ידי מערכת עור...

Discussion

השיטה המתוארת כאן מבוססת על הכנת תרבות astrocyte ממוח של ילוד מכרסם, שתואר לראשונה על ידי מקארתי ודה Vellis בשנת 1980 ^27. השיטה השונה של הבידוד והתרבות של האסטרוציטים קליפת המוח מP1 לאחר הלידה למוח עכבר P4 מוצגת כאן הוא מהיר, תשואות האסטרוציטים ראשוניים וטהורים וניתן לשחזור...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שמו של פתרון עובד	חברה	מספר קטלוגים	ריכוז סופי
			תקשורת התרבות astrocyte
DMEM, רמת סוכר גבוה	חי טכנולוגיות	31966-021
FBS, חום מומת	חי טכנולוגיות	10082-147	ריכוז סופי: 10%
פניצילין סטרפטומיצין	חי טכנולוגיות	15140-122	ריכוז סופי: 1%
			פתרון לעקיצת רקמת המוחestion
HBSS	חי טכנולוגיות	14170-088
2.5% טריפסין	חי טכנולוגיות	15090-046	ריכוז סופי: 0.25%
			אחר
70% אתנול (כרך / כרך)	רוט	9065.2
פולי-D-ליזין	Millipore	-003-E	50 מיקרוגרם / מ"ל
מים	Paa	S15-012	כיתת תרבית תאים
PBS	Paa	H15-002	כיתת תרבית תאים
0.05% נסוpsin-EDTA	חי טכנולוגיות	25300-062
0.45 סינון סטרילי מיקרומטר	סארטוריוס	16555
3.5 צלחת פטרי סנטימטר	BD פלקון	353001
15 מיליליטר צינור פלקון	BD פלקון	352096
50 מ"ל פלקון צינור	BD פלקון	352070
75 בקבוק התרבות 2 סנטימטר רקמות	BD פלקון	353136
מלקחיים, בסדר	דומון	2-1032; 2-1033	# 3 ג; # 5
מלקחיים, קצה שטוח	KLS מרטין	12-120-11
13 סנטימטר מספרי כירורגיות	Aesculap	BC-140-R
Stereomicroscope	ליקה		MZ7.5
סטראו + מצלמה	ליקה		MZ16F; DFC320
מיקרוסקופ + מצלמה	Zeiss; Canon		פרימו רט; A650 IS PowerShot
סרכזת	אפנדורף	5805000.017	Centrifuge5804R
Orbital אכר	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
אמבט מים	Julabo		SW20; 37 מעלות צלזיוס