Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

Resumen

Los astrocitos se han reconocido para ser versátiles células que participan en los procesos biológicos fundamentales que son esenciales para el desarrollo normal del cerebro y la función, y la reparación del sistema nervioso central. Aquí presentamos un procedimiento rápido para obtener cultivos puros de astrocitos de ratón para estudiar la biología de esta clase importante de centrales células del sistema nervioso.

Resumen

Los astrocitos son un tipo de células abundante en el cerebro de los mamíferos, pero aún queda mucho por aprender acerca de sus características moleculares y funcionales. Astrocitos in vitro de sistemas de cultivo celular se puede utilizar para estudiar las funciones biológicas de estas células gliales en detalle. Este protocolo video muestra cómo obtener los astrocitos puras mediante el aislamiento y la cultura de una mezcla de células corticales de crías de ratón. El método se basa en la ausencia de neuronas viables y la separación de los astrocitos, los oligodendrocitos y microglia, las tres poblaciones principales de células gliales del sistema nervioso central, en cultivo. Imágenes representativas durante los primeros días de cultivo demostrar la presencia de una población de células mixtas e indicar el punto de tiempo, cuando los astrocitos se hacen confluentes y debe ser separado de microglia y oligodendrocitos. Por otra parte, se demuestra la pureza y la morfología astrocytic de astrocitos en cultivo utilizando tinciones inmunocitoquímicas para bien establecidos yrecién descrito marcadores de astrocitos. Este sistema de cultivo puede ser fácilmente utilizado para obtener los astrocitos puros ratón y el medio acondicionado de astrocitos para el estudio de diversos aspectos de la biología de astrocitos.

Introducción

Los astrocitos son un tipo de célula muy abundantes en el sistema nervioso central (SNC). La relación de los astrocitos de las neuronas es de 1:3 en la corteza de ratones y ratas, mientras que hay 1,4 astrocitos por neurona en la corteza humana ^1. El interés en función de los astrocitos se ha incrementado dramáticamente en los últimos años. Una función clave de los astrocitos es su papel en la prestación de apoyo estructural y metabólico de las neuronas ^2,3. Papeles recién descubiertas de astrocitos cubren un amplio espectro de funciones. Estos incluyen guiar la migración de los axones en desarrollo y los neuroblastos determinadas durante el desarrollo de ^4-6, funciones en la transmisión sináptica, la fuerza de sinapsis y procesamiento de la información por los circuitos neuronales ^7-9, roles en la barrera hematoencefálica (BBB) ​​formación ¹⁰ y la integridad ^11-13 y la regulación del tono vascular cerebral ^14. Otra característica importante de los astrocitos es su respuesta a la lesión. Bajo condiciones patológicas astrocytES vuelven reactivos y más regular al alza la expresión de la proteína de filamentos intermedios ácida fibrilar glial (GFAP) y proteínas inhibidoras de la matriz extracelular (ECM) ^15,16. Astrocitos reactivos demarcar el sitio de la lesión del tejido sano mediante la formación de una cicatriz glial, que consiste principalmente en astrocitos proteínas secretadas de ECM de la proteoglicano sulfato de condroitina (CSPG) de la familia, los principales factores que inhiben la regeneración axonal después de una lesión del SNC ^15-17.

Los astrocitos se originan en gliales radiales (RG) de las células durante la embriogénesis tardía y la vida postnatal temprana. Después de especificación de astrocitos se ha producido, precursores de astrocitos migran a sus posiciones finales, en el que comienzan el proceso de diferenciación terminal. In vivo, los astrocitos parecen ser maduro tres a cuatro semanas después del nacimiento, como se indica por su morfología típica de ^18,19. Una subpoblación de células RG convertir en astrocitos de la zona subventricular (tipo de células B). Both, RG y células de tipo B funcionar como astrocitos como células madre neurales (NSC) durante el desarrollo y en el adulto, respectivamente. Al igual que los astrocitos, RG y células de tipo B también expresan el transportador de glutamato específico de astrocitos (GLAST), cerebro lípido-proteína de unión (BLBP), y GFAP, lo que indica que estos marcadores no pueden ser exclusivamente utilizado para etiquetar específicamente astrocitos adultos. En contraste con los astrocitos adultos parenquimatosas, que no se dividen en el cerebro sano RG, y el tipo B muestra células tallo potencial de la célula tales como la capacidad de auto-renovación. La desregulación de los astrocitos se ha implicado en numerosas patologías, incluyendo la enfermedad de Alzheimer ^20,21, enfermedad de Huntington ^{22, 23} enfermedad de Parkinson, síndrome de Rett ²⁴ y enfermedad de Alexander ^25. Por otra parte, los astrocitos reaccionar a todos los insultos del SNC, que conduce a la activación de astrocitos y la formación de cicatriz glial astrocytic ^16,26. La cicatriz glial astrocytic que forma tr cerebro siguienteauma lesión o la médula espinal se piensa que es la barrera primer impedir la regeneración neuronal ^15.

El desarrollo de métodos fiables para aislar y mantener las poblaciones purificadas de células ha sido esencial para nuestra comprensión del sistema nervioso. Los trabajos pioneros de McCarthy y de Vellis permite a los investigadores hasta la fecha para preparar cultivos casi puros de astrocitos de rata neonatal tejido ^27. Se ha aprendido mucho sobre la biología de los astrocitos utilizando este método, que se presenta aquí en una forma ligeramente modificada para aislar los astrocitos corticales de ratón. Como complemento de los estudios in vivo, los astrocitos, así como el medio condicionado obtenido utilizando el descrito en el cultivo in vitro, son herramientas valiosas para obtener más ideas sobre las funciones de los astrocitos.

Protocolo

1. El aislamiento y forro de una mezcla de células corticales

Aislamiento de células mixtas para cultivos de astrocitos corticales se puede realizar utilizando P1 a P4 crías de ratón. Con el fin de conseguir una densidad de astrocito adecuado, es necesario el uso de 4 capas corticales de ratón pup por T75 matraz de cultivo de tejido. Por lo tanto, los volúmenes en el protocolo siguiente se calculan para una preparación de células usando 4 crías de ratón.

1. Antes de iniciar el procedimiento de disección, precalentamiento 30 ml de medios de cultivo de astrocitos (DMEM, alta glucosa + 10% inactivado por calor suero fetal bovino + 1% de penicilina / estreptomicina; véase la tabla) a 37 ° C. Cubra un matraz T75 con 20 ml de poli-D-lisina (PDL) a una concentración de 50 mg / ml en agua de grado de cultivo de células durante 1 hora a 37 ° C en la incubadora de CO _2.
2. Para el procedimiento de disección, preparar todos los reactivos y materiales necesarios. Usted necesitará: tijeras quirúrgicas, pinzas finas lisas, pinzas de punta plana, toallas de papel, bolsas de residuos, un 70% de etanold 2 platos de disección (3,5 cm de diámetro) en el hielo llena con 2 ml de HBSS cada uno.
3. Aplique suavemente y rociar la cabeza y el cuello del ratón cachorro con 70% de etanol. El animal es sacrificado por decapitación con las tijeras.
4. Realizar una incisión en línea media, de posterior a anterior, a lo largo del cuero cabelludo para revelar el cráneo.
5. Cortar cuidadosamente el cráneo desde el cuello hasta la nariz. Dos cortes adicionales se realizan para permitir el acceso adicional al cerebro: El primer corte se hace anterior de los bulbos olfatorios, la otra inferior del cerebelo para desconectar el cráneo de la base del cráneo.
6. Uso de las pinzas de punta plana, las aletas craneales se volcó suavemente a un lado y el cerebro se extrae y se coloca en el plato primero disección llena con HBSS. Coloque el plato de nuevo en hielo y seguir cosechando los 4 cerebros.
7. El resto del procedimiento de disección se realiza bajo un estereomicroscopio. En primer lugar, los bulbos olfatorios y el cerebelo se eliminan mediante la multafórceps de disección (Figura 1B).
8. Con el fin de recuperar las cortezas, agarra el extremo posterior del cerebro con las pinzas finas, realizar una incisión en línea media entre los hemisferios, insertar un segundo conjunto de pinzas de la arboleda creado y se desprenden de la estructura en forma de placa de la corteza de la cerebro.
9. Diseccionar cuidadosamente las meninges de la corteza de los hemisferios tirando con las pinzas finas (Figura 1 D '). Este paso evita la contaminación del cultivo de astrocitos final por células de las meninges y los fibroblastos. Transfiera los hemisferios corticales preparados en el segundo plato lleno de HBSS y devolverlo en hielo. Continuar en consecuencia con todas las 4 capas corticales.
10. Por último, cortar cada hemisferio corteza en trozos pequeños con cuchillas afiladas (aproximadamente 4 a 8 veces).
11. En condiciones estériles, piezas de transferencia de corteza en un tubo Falcon de 50 ml y añadir HBSS hasta un volumen total de 22,5 ml.
12. Añadir 2,5 ml de tripsina al 2,5%, mezclar e incubarel tejido en el baño de agua a 37 ° C durante 30 min. Mezclar por agitación ocasional cada 10 min.
13. Centrifugar durante 5 min a 300 xg para piezas de pellets tejido de la corteza.
14. Retire con cuidado el sobrenadante por decantación. Con el fin de evitar la pérdida del sedimento de tejido que puede retener mecánicamente usando una pipeta. Disociar el tejido en una suspensión de células individuales mediante la adición de 10 ml de medio de recubrimiento de astrocitos y pipeteado vigoroso usando una pipeta de plástico de 10 ml hasta trozos de tejido se disocia en células individuales (20 a 30 veces). Ajuste el volumen a 20 ml con medio chapado astrocitos. Puede prueba de la disociación del tejido de la corteza en células individuales mediante recuento usando un hematocitómetro. Una preparación de 4 cortezas de ratón cachorro debe ceder 10-15 x 10 ⁶ células individuales disociados.
15. Aspirar PDL del matraz de cultivo T75, placa de la suspensión disociado sola célula y se incuba a 37 ° C en la incubadora de CO _2.

2. Obtención de una EnrCultura Astrocyte iched

1. Cambiar el medio 2 días después de la siembra de las células mixtas corticales y los 3 días posteriormente.
2. Después de 7 a 8 días, cuando los astrocitos son confluentes microglia y superposición sentarse expuestos en la capa de astrocitos o que ya están separados de la capa de astrocitos (Figura 2), agitar el matraz T75 a 180 rpm durante 30 min en un agitador orbital para eliminar la microglía. Desechar el sobrenadante que contiene microglia o si desea examinar la cultura y la microglia, lo hace girar hacia abajo y la placa de la cultura ^28,29.
3. Añadir 20 ml de medio fresco cultivo de astrocitos y continuar agitando el matraz a 240 rpm durante 6 horas para eliminar las células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Dado que algunos OPC no se desprenderá completamente de la capa de astrocitos, siguen agitar fuertemente durante 1 min con el fin de evitar la contaminación OPC. Desechar el sobrenadante o girar hacia abajo y la placa, si lo desea con la cultura OPC ^29.
4. Enjuague el conflue restantent capa de astrocitos dos veces con PBS, aspirar el PBS, añadir 5 ml de tripsina-EDTA y se incuban en la incubadora de CO ₂ a 37 ° C. Compruebe la separación de los astrocitos cada 5 minutos y hacer cumplir la separación de los astrocitos golpeando el frasco en la palma de tu mano (2-3 veces).
5. Después de astrocitos se desprenden del matraz de cultivo, añadir 5 ml de medio de cultivo de astrocitos, células giran a 180 xg durante 5 min, aspirar el sobrenadante y añadir 40 ml de medio fresco chapado de astrocitos. Uno T75 frasco de cultivo de tejidos deben producir alrededor de 1x10 ⁶ células después de la división celular en primer lugar. Células de la placa en dos matraces T75 de cultivo y se incuba a 37 ° C en la incubadora de CO _2. Cambiar el medio cada 2 a 3 días.
6. 12-14 días después de la primera división de los astrocitos se sembraron en la concentración apropiada de células 24-48 horas antes de realizar el experimento. Uno T75 frasco de cultivo de tejidos deben producir alrededor de 1.5-2 x 10 ⁶ células después de la división celular segundo.

Resultados

Tras el aislamiento del cerebro de ratón completo (Figura 1A), el cerebelo y el bulbo olfativo tiene que ser eliminado (Figura 1B). Las cortezas se pelan del vástago de cerebro de ratón (Figura 1C) y de las meninges de la corteza individual (Figura 1D ') se retiran cuidadosamente (Figura 1E). Meninges son evidentes por el sistema de la arteria meníngea y resultados incompletos de eliminación de contaminación en el cultivo de a...

Discusión

El método descrito aquí se basa en la preparación de cultivo de astrocitos a partir de cerebros de roedores neonatos, originalmente descrito por McCarthy y de Vellis en 1980 ^27. El método modificado del aislamiento y el cultivo de astrocitos corticales a partir de P1 a P4 postnatal cerebro de ratón se presenta aquí es rápido, los rendimientos de los astrocitos primarios puros y es altamente reproducible. Esta técnica se puede transferir fácilmente para aislar los astrocitos a partir de otras especies...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre de la solución de trabajo	Empresa	Número de catálogo	Concentración final
			Medios de cultivo de astrocitos
DMEM, alta glucosa	Life Technologies	31966-021
FBS, inactivado por calor	Life Technologies	10082-147	Concentración final: 10%
Penicilina-Estreptomicina	Life Technologies	15140-122	Concentración final: 1%
			Solución para la excavación del tejido cerebralestion
HBSS	Life Technologies	14170-088
2,5% de tripsina	Life Technologies	15090-046	Concentración final: 0,25%
			Otro
70% (vol / vol) de etanol	Roth	9065.2
Poli-D-lisina	Millipore	A-003-E	50 ug / ml
Agua	PAA	S15-012	grado celda de la cultura
PBS	PAA	H15-002	grado celda de la cultura
Trate de 0,05%psin-EDTA	Life Technologies	25300-062
0,45 filtro estéril micras	Sartorio	16555
3,5 cm plato de Petri	BD Falcon	353001
15 ml Falcon tubo	BD Falcon	352096
50 ml Falcon tubo	BD Falcon	352070
75 cm 2 matraz de cultivo tisular	BD Falcon	353136
Pinzas, bien	Dumont	2-1032, 2-1033	# 3c, # 5
Pinzas, punta plana	KLS Martin	12-120-11
13 cm tijeras quirúrgicas	Aesculap	BC-140-R
Estereomicroscopio	Leica		MZ7.5
Estereomicroscopio + cámara	Leica		MZ16F; DFC320
Microscopio con cámara +	Zeiss, Canon		Primo Vert; PowerShot A650 IS
Centrífugo	Eppendorf	5805000.017	Centrifuge5804R
Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Baño de agua	Julabo		SW20, 37 ° C