分离新生小鼠心肌文化和

摘要

原代小鼠心肌细胞培养物的肌原纤维组织和功能的研究的关键工具之一。以下协议描述了从新生小鼠心脏原发性心肌细胞的分离和培养。所得到的心肌细胞培养物随后可用于各种生物力学，生物化学和细胞生物学测定。

摘要

培养的乳鼠心肌细胞长期被用来研究肌丝和肌原纤维的功能。培养的心肌细胞可以很容易调查的生化途径和操作，以及它们对自发跳动的心肌细胞的生物力学特性的影响。

下面2日协议描述的新生小鼠心肌细胞的分离和培养。我们将展示如何轻松地从新生儿心脏解剖，游离心脏组织，并从心脏细胞群丰富的心肌细胞。我们讨论了不同酶混合的用法细胞解离，及其对细胞活力的影响。分离的心肌细胞随后可以用于各种形态，电生理，生化，细胞生物或生物力学分析。我们优化了协议鲁棒性和再现性，通过仅使用市售溶液和酶混合了的shOW小批与批之间变化。我们还应对与心肌细胞的分离和培养相关的常见问题，并提供了多种用于分离和培养条件的优化选项。

引言

对啮齿动物的心脏细胞的成功分离并培养了最早报道可以追溯到1960年的^1,2。即使这样，Harary和法利注意到，培养的心肌细胞"可提供的周期性收缩的要求，研究一个独特的系统[，并可能]提供确定的[跳动]过程中的各种代谢途径的贡献的一种手段"。虽然Harary和法利从幼鼠，和原来的协议分离培养的心肌细胞已被改编，被许多科学家修改多年来，一般隔离和培养过程并没有很大的变化。然而，更好的酶^3，标准化解决方案^4,5和加法可逆信道和肌球蛋白ATP酶抑制剂BDM分离过程^6-9期间保护细胞的有显著改善细胞产量和活力。

成人与新生大鼠心肌核细胞

心肌细胞的分离，培养新生小鼠或大鼠有超过成人的心肌细胞培养几个优点。最重要的，在分离过程中对新生小鼠或大鼠心脏更容易且成本更低，相对于从成年小鼠或大鼠心肌细胞¹⁰的隔离。新生心肌远远不敏感，再引入含钙介质离解后，极大地提高细胞产量。另一大优势是，新生小鼠心肌细胞进行更快速的分化 - 再分化周期，通常会产生电镀后自发跳动的细胞20小时，而成人的心肌细胞通常需要起搏诱导收缩。乳鼠心肌细胞也更容易转染的脂质体转染方法，而成人的心肌细胞需要病毒载体成功传递转基因DNA的。相反，新​​生心肌细胞秒，成年啮齿动物心肌^11-13文化允许的肌原纤维的降解和收缩设备的最终重建的调查。在成人的心肌细胞，这些特征的形态学变化发生在1-2周时间。去分化-再分化周期是伴随胎儿基因程序的再表达，从而模拟在人心肌病¹⁴观察到的病理变化。成年大鼠心肌细胞在新生大鼠心肌文化的另一个优点是能够培养这些细胞很长一段时间。

大鼠与小鼠的心肌细胞

新生大鼠心肌细胞的分离和培养有一定的好处超过了小鼠乳鼠心肌细胞，包括活细胞的产量更高，增加了转染率。然而，转基因小鼠模型心脏疾病的广泛使用（ 如</ em>的肌肉LIM蛋白基因敲除小鼠为模型，扩张型心肌病^15），导致了分离过程的适应从新生小鼠的心肌。虽然用于分离新生大鼠和小鼠心肌的协议几乎是相同的，更大的关怀必须采取适当的酶混合物，后者的选择。事实上，新生小鼠心肌细胞一般都比较容易过量，造成降低的细胞产量和活力。此外，铺板密度应调整，因为相比于从新生大鼠心脏的细胞从新生小鼠衍生的心肌细胞是要小一些。

与许多用途的形态，电生理，生物化学，细胞生物学和生物力学参数以及为肌丝的过程进行调查，培养的乳鼠心肌细胞已成为最通用的系统的研究之一心肌细胞功能的体外 。第一步，一个成功的实验然而，依赖于一个简单而可靠的方法来隔离乳鼠心肌细胞。我们的协议借鉴其方法有很多，是为再现性和鲁棒性优化。我们讨论了影响心肌的产量和活力的因素，以及对分离和培养条件的优化提供了多种选择。

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研究方案

下面的过程描述了为期两天的协议^16,17对新生小鼠心肌细胞的分离和培养。所有溶液是无菌的或无菌过滤。所有的工具都通过表面杀菌消毒用75％的乙醇。除了最初的组织提取，所有步骤都在无菌层流细胞培养罩进行。此协议的目的是为新生小鼠心脏从一个个垃圾（次）的隔离 - 约5-14幼崽，但可以适用于较大的窝产仔数和新生大鼠心肌细胞。规模媒体/酶用量（如适用）。

对于新生儿啮齿动物的工作，是指规定由立法机关和/或动物护理方案您当地的大学指引和规则，并坚持你的制度上批准的动物协议。在本协议中所述的所有方法已获得加州大学圣地亚哥分校机构动物护理和使用委员会（IACUC），并坚持FEDE拉尔和国家有关规定。

每日1次。

1。从新生小鼠心肌组织中分离

1. 制备50毫升的1X PBS（无Ca ^{2 +}的，Mg ^{2 +}的），补充有20mM BDM ^6-8，并分散到置于冰上2无菌细菌菜肴。
2. 准备10毫升分离培养基的50ml的无菌锥形Falcon管中。置于冰上的所有解决方案。消毒剪刀（一个弯，一条直线），和钳（弯，杜蒙第7号）。
3. 1-3日龄新生小鼠在表面杀菌75％的乙醇溶液快速冲洗。幼仔用无菌剪刀（直）断头，胸部沿着胸骨打开，以允许访问胸腔和心脏（ 图1A中 ， 追加电影S1）。
   技术评论:年长超过3天新生小鼠可以使用，但导致更少的活细胞^2。
4. 心是摘录自主体具有弯曲剪刀和用20mM BDM立即转移到细菌培养皿含有1x PBS（不含Ca ^{2 +，Mg 2 +}的），在冰上。所有以下步骤在无菌的细胞培养罩进行。
5. 去除肺组织，较大的血管（和心房，如果需要的话）。洗心在1X PBS液（不含Ca ^{2 +，Mg 2 +}的）与20毫米BDM（冰），以清除血液。转让洗涤从第一盘心进入第二细菌培养皿含有1x PBS（不含Ca ^{2 +，Mg 2 +}的）与使用镊子的20mM BDM（在冰上）或穿孔的勺子（ 图1B）。
6. 转让清洗/清洗的心，一滴分离培养基（约250微升; 图1C）在第三细菌培养皿（冰），并使用剪刀弯剁碎的心切成小块（约0.5-1毫米^3，或更小; 图1D，1E）。
7. 转心剁碎成圆锥形含有10毫升分离培养基（在冰上）的管中，并轻轻摇动孵育在4℃下过夜。

第2天。

2。酶消化组织细胞及电镀

1. 称重在15毫克胶原酶/分散酶混合物（罗氏公司），并溶解酶混合物在10ml ^L15-5介质补充有20mM的BDM（消化培养基）。无菌过滤的消化培养基在细胞培养罩到一个新的无菌50毫升Falcon管中。
2. 准备30毫升的L-15培养基中添加20mM的BDM和镀敷介质。
3. 外套细胞培养板的胶原蛋白溶液（Sigma C-8919）最少1小时的。除去胶原溶液（可重复使用）和干胶原包被细胞培养皿中无菌层流细胞培养罩。
4. 取出锥形管含有从4℃的简化的心组织碎片应合并计算（ 图1G）。让组织碎片沉入在管的底部，去除上清（确保不丢失任何组织片段;通常，约1ml所隔离介质的可保留在管）。加入5 ml消化介质和5毫升的L-15的补充有20mM的BDM到组织片段，并使用氧气或空气为1分钟含氧化合物的悬浮液。
5. 密封锥形管中含有消化培养基的心脏组织片段转移到37℃水浴中约2分钟，以调节消化溶液的温度。
6. 孵育心肌组织片段在37℃下缓慢搅拌20-30分钟（ 例如摇动器在37℃下，设定为不超过60转以上）。消化时间可能大大依赖于酶的混合物，并批号注意:较长的潜伏期或更高的酶浓度可能会降低细胞活力。

技术注释:我们建议胶原酶/分散酶混合物的使用量从罗氏（编号:10269638001），有非常少很多到很多变化。经典的酶的小鼠心肌细胞的分离的胰蛋白酶和/或胶原酶II型^3,16-20可从Worthington（目录号CLS-2）。然而，胶原酶Ⅱ的性能可能从很多到很多差别很大。沃辛顿通常允许几个胶原酶大量的测试，优化消化时间和酶用量。另外，沃辛顿生产销售心肌细胞分离试剂盒与预测试的酶混合物，包括可适应对小鼠心肌细胞^17（目录号:NCIS）的隔离。

7. 将无菌细胞过滤器（40-100微米尼龙网）的新鲜无菌的50ml锥形猎鹰管。预湿的细胞过滤，用5ml的L-15补充有20mM的BDM。使用预润湿10毫升细胞培养移液器约10-20倍轻轻磨碎的组织碎片。组织碎片应该在这个步骤大多分散，释放出细胞进入悬索桥N（ 图1H）。
8. 让更大的组织碎片沉淀和含悬浮细胞到新鲜的锥形管通过细胞过滤器（ 图1I）转移上清。
9. 重悬未消化的组织碎片在5ml消化培养基孵育额外的5-10分钟，在37℃下缓慢搅拌。
10. 其余的组织碎片继续消化后，轻轻磨碎组织的10-20倍，并加入到锥形管含有细胞从第一通过消化细胞过滤。漂洗细胞器 - 网式过滤，用5ml的L-15添加20mM BDM允许所有消化细胞的通道。
11. 离心锥形管含有悬浮的心肌细胞在300转5分钟（约50-100 XG）。除去上清液（主要含有成纤维细胞和内皮细胞）和在10ml平板培养基重悬细胞沉淀。
12. 板细胞进入10厘米细胞培养皿（ 图2A）并孵育1-3小时在细胞培养孵化器。此预镀步骤除去成纤维细胞和内皮细胞（ 图2B），这将附着在未涂覆的细胞培养皿中（ 图2C）。
13. 温育后，（通过反复吹打在盘镀介质重新悬浮细胞）洗涤非贴壁心肌将从10cm培养皿中，并传输重悬细胞于无菌锥形猎鹰离心管（15毫升或50毫升）中。
    可选:重复镀前一步，从细胞悬液中删除额外的成纤维细胞。如果需要的话，粘合成纤维细胞和内皮细胞可进一步培养。
14. 细胞计数（ 如使用的Neubauer血细胞计数，台盼蓝拒染^21）。
15. 板的细胞在胶原包被细胞培养皿以每厘米^2（ 图2D约1.5×10 ⁵个细胞的密度，也可参见评论于表1上镀和涂层）。
    将餐具放入细胞培养孵化器，离开静置12-18小时，以便坚持和心肌细胞的扩散。

第3天 - 乳鼠心肌细胞的培养

1. 准备维修中，prewarm在37℃水浴。参照表1的除了增殖抑制剂或变时性剂，或程序的新生小鼠的心肌细胞的脂质体转染。
2. 有一天电镀后，心肌细胞应该坚持的细胞培养皿，最佳开始自发地收缩（ 图2E，2F，补充电影S2，参考表2为隔离/养殖过程中常见的问题）。更换电镀液与维持液和培养更多的1-5天。改变介质是必要的。

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结果

使用此协议，我们分离的心从8一日龄新生小鼠（ 图1A，1B，追加电影S1）。洗涤和切碎的心，用剪刀（ 图1C-1F）后，组织碎片在预消化分离培养基过夜，4℃，轻轻摇动。以下简化（ 图1G），我们将其组织碎片进入新鲜的消化培养基，并温育的组织碎片20分钟，在37℃下缓慢搅拌。将所得细胞悬浮液（ 图1H），是通过细胞过滤网（ 图1G）

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讨论

利用动物模型来研究心脏疾病在心血管研究已经成为标准。这些模型的建立更紧密的生化特性（ 即研究心肌细胞的直接反应，生物化学或生物力学刺激）通常需要心脏组织或心肌细胞的分离。调查研究心脏的生理反应体外 （ 如对乙酰胆碱^40，或在缺血再灌注场景^41）一般采用的Langendorff灌注整个心灵^42,43，而植体培养心肌组织碎片^44,45允许对心?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	cellgro	10-013-CV
M-199	cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	Falcon	357551
30 mm cell culture dish	Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.