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요약

기본 마우스 심근 문화는 근원 섬유 조직과 기능의 조사를 위해 중요한 도구 중 하나입니다. 다음 프로토콜은 신생아 마우스 마음에서 차 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 얻어진 심근 배양 이후 역학적, 생화학 및 세포 생물학의 다양한 분석을 위해 사용될 수있다.

초록

교양 신생아 심근 긴 myofibrillogenesis와 근원 섬유의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 배양 심근 쉽게 조사 및 조작 생화학 경로, 그리고 자발적으로 심근 박동의 생 역학적 특성에 미치는 영향에 대해 수 있습니다.

다음 2 일간의 프로토콜은 신생아 마우스 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 우리는 쉽게, 신생아에서 마음을 해부 심장 조직을 떼어 놓다 및 심장 세포 집단에서 심근을 풍부하게하는 방법을 보여줍니다. 우리는 세포 분리에 대해 서로 다른 효소 혼합물의 사용, 세포 생존 능력에 미치는 영향에 대해 설명합니다. 고립 된 심근 이후에 형태 학적, 전기 생리학, 생화학, 세포 생물학 또는 생체 역학 분석의 다양한 사용할 수 있습니다. 우리는 단지 시판되는 용액을 사용하여, 견고성과 재현성을위한 프로토콜을 최적화 효소 혼합물이 SH오우 작은 로트의 변화. 우리는 또한 심근의 분리 및 문화와 관련된 일반적인 문제를 해결하고, 분리 및 배양 조건의 최적화를위한 다양한 옵션을 제공합니다.

서문

쥐의 심장 세포의 성공적인 해리와 문화에 대한 최초의 보고서는 다시 1960 년대 1, 2로 거슬러 올라갑니다. 그렇다하더라도, Harary 및 팔리 배양 심근는 "주기적인 수축의 요구 사항의 연구를위한 독특한 시스템을 제공 할 수있다 [월] [치는] 프로세스의 다양한 대사 경로의 기여를 결정하는 수단을 제공하는"것으로 나타났습니다. 젊은 쥐, 원래의 프로토콜에서 Harary 및 팔리 격리 배양 심근 수년에 걸쳐 적응 많은 과학자들에 의해 수정되었지만, 일반적으로 분리 및 배양 과정은 크게 변경되지 않았습니다. 그러나, 더 나은 효소 3, 표준화 된 솔루션 4,5 및 분리 절차 동안 6-9 세포를 보호하기 위해 가역 채널 및 미오신 ATPase의 억제제 BDM의 첨가는 크게 휴대 수율 및 생존을 개선했다.

신생아 cardiomyo 대 성인cytes

신생아 생쥐 나 쥐에서 분리 배양 심근 성인 심근의 문화에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 성인 마우스 또는 쥐 10에서 심근의 분리에 비해 제일, 신생아 마우스 또는 쥐 마음의 분리 절차는 쉽고 적은 비용이다. 신생아 심근 크게 세포 수율을 증가하고, 분리 한 후 칼슘 함유 배지에 재 도입에 훨씬 덜 민감하다. 성인 심근는 일반적으로 수축을 유도하기 위해 서성 필요로하지만 일반적으로, 자발적으로 도금 한 후 세포를 20 시간을 치고 결과 재분화주기 - 또 다른 큰 장점은 신생아 마우스의 심근이 더 빠른 탈분화를 받아야한다는 것입니다. 성인 심근는 형질 전환 DNA의 성공적인 전달을 위해 바이러스 성 벡터를 필요로하는 반면 신생아 심근은 더 쉽게 또한 리포좀 형질 전환 방법과 형질이다. 신생아 심장 근세포 대조적의, 성인 쥐 심근 11-13의 문화는 근원 섬유 저하 및 수축성 장치의 궁극적 인 회복의 조사를 할 수 있습니다. 성인 심근에서 이러한 특성을 형태 학적 변화는 1-2 주 기간에 걸쳐 발생합니다. 탈분화 - 재분화주기함으로써 인간의 심근 병증이 14에서 관찰 된 병리학 적 변화를 흉내 낸, 태아 유전자 프로그램의 reexpression 함께합니다. 신생아 심근 세포의 배양을 통해 성숙한 래트 심근 세포의 또 다른 장점은 오랜 시간 동안 배양 할 수있는 능력이 세포이다.

마우스 심근 대 쥐

쥐 신생아 심근의 분리 및 배양 가능한 세포의 높은 수율 증가 형질 전환 속도 등의 마우스 신생아 심근의 그 이상 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 심장 질환에 대한 유전자 변형 마우스 모델의 광범위한 사용 (예를 들어 </ 엠> 확장 성 심근증 15 모델과 근육 임 단백질 녹아웃 마우스) 신생아 쥐에서 유래 심근 세포의 분리 절차의 적응되었다. 신생아 래트 심근 세포 및 마우스를 분리하는 데 사용되는 프로토콜은 거의 동일하지만, 그레이트 손질 후자위한 적절한 효소 믹스의 선택에주의해야한다. 사실, 신생아 마우스의 심근이 감소 된 세포 수율과 생존의 결과로, 일반적으로 overdigestion에 더 취약합니다. 신생아 생쥐 유래 심근 신생아 래트 심장 유래의 세포에 비해 다소 작은 때문에 또한, 도금 밀도는 조정되어야한다.

형태 학적, 전기 생리학, 생화학, 세포 생물학 및 생체 역학 매개 변수뿐만 아니라 myofibrillogenesis의 프로세스의 조사를 위해 많은 용도로, 배양 신생아 심근는 연구를위한 가장 다양한 시스템 중 하나가되고 있습니다체외에서 심장 세포 기능. 성공적인 분석의 첫 번째 단계는하지만, 신생아 마우스 심근를 분리 할 수​​있는 쉽고 안정적​​인 방법에 따라 달라집니다. 우리의 프로토콜은 다양한 소스에서의 방법론을 그리고 재현성 및 안정성을 위해 최적화되었다. 우리는 심근 세포 수율과 생존에 영향을 미치는 요인에 대해 설명하고, 분리 및 배양 조건의 최적화를위한 다양한 옵션을 제공합니다.

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프로토콜

다음 절차는 신생아 마우스 심근의 분리 및 문화에 대한 이틀간의 프로토콜 (16, 17)에 대해 설명합니다. 모든 솔루션은 살균 또는 멸균 필터링됩니다. 모든 공구는 75 %의 에탄올로 표면을 살균 소독한다. 초기 티슈 추출을 제외하고, 모든 단계는 무균 층류 세포 배양 후드에서 수행된다. 이 프로토콜은 하나, 둘, 쓰레기 (들)에서 신생아 마우스 마음의 분리를위한 것입니다 - 약 5-14 새끼,하지만 더 큰 쓰레기의 크기와 쥐 신생아 심근을 위해 구성 될 수있다. 적절한 규모의 미디어 / 효소 사용.

신생아 설치류와 작업의 경우, 의회 및 / 또는 동물 관리 프로그램에 의해 규정 된 지역 대학 지침 및 규칙을 참조하여 제도적으로 승인 된 동물 프로토콜을 준수. 이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 UC 샌디에고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을, 그리고 FEDE에 부착 된RAL 및 주 규정.

1 일.

1. 신생아 쥐의 심장 조직의 분리

  1. 20 mM의 BDM 6-8로 보충 (칼슘 2 +, Mg를 2 +없이) 1X PBS 50 ㎖를 준비하고, 얼음에 배치 된 두 개의 멸균 세균 요리에 분산.
  2. 50 ㎖ 멸균 원뿔 팔콘 튜브에 격리 매체의 10 ㎖를 준비합니다. 얼음에 모든 솔루션을 유지합니다. 그리고 집게 (곡선, 뒤몽 7 번), 가위 (하나의 직선 곡선을) 소독.
  3. 1-3일 된 신생아 마우스는 표면 살균에 대한 75 %의 에탄올 용액에 신속하게 세척된다. 새끼는 멸균 가위 (직선)을 사용하여 참수하고, 가슴은 흉강에 대한 액세스 및 심장 (그림 1A, 보충 영화 S1)을 허용하는 흉골을 따라 열립니다.
    기술 코멘트 : 3 일 이전의 신생아 마우스는 사용하지만, 적은 가능한 세포 2 발생할 수 있습니다.
  4. 하츠에서 추출곡선 가위로 몸과 20 mM의 BDM과 (칼슘 2 +, Mg를 2 +없이) 1X PBS를 포함하는 박테리아 접시에 즉시 전송, 얼음. 모든 다음 단계는 무균 세포 문화 후드에서 수행됩니다.
  5. (원하는 경우, 및 심방) 폐 조직, 큰 혈관을 제거합니다. 1X PBS 용액에 세척 하트 (칼슘없이 2 +, Mg를 2 +) 20 mM의 BDM (얼음)와 혈액을 제거합니다. 전송 20 MM (얼음) BDM 집게를 사용하거나 구멍 스푼 (그림 1B)와 (칼슘 2 +, Mg를 2 +없이) 1X PBS를 포함하는 두 번째 박테리아 접시에 첫 번째 접시에서 마음을 씻어.
  6. 전송 청소 / 절연 매체의 드롭 (약 250 μL, 그림 1C)에 마음을 세척 (얼음) 세 번째 박테리아 접시에 작은 조각 (약 0.5 mm 3 이하로 마음을 말하다 곡선 가위를 사용한다; 그림 1D, 1E).
  7. 원추형으로 다진 마음을 전송튜브 (얼음) 절연 매체의 10 ㎖를 포함, 밤에 4 ° C에서 교반과 함께 배양한다.

2 일.

2. 세포의 효소 조직 소화 도금

  1. 콜라게나 / 디스 파제 혼합물 (로슈)의 15 밀리그램의 무게를, 20 mM의 BDM (소화 매체)로 보충 10 ㎖ L15 매체 5 효소 믹스를 녹입니다. 살균 필터 새로운 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 세포 배양 후드에서 소화 매체.
  2. 30 ML L-15 20 mM의 BDM 보충 매체와 도금 매체를 준비합니다.
  3. 1 시간의 최소 콜라겐 용액 (시그마 C-8919)를 가진 외투 세포 배양 플레이트. 멸균 층류 세포 문화 후드에 콜라겐 용액 (재사용 할 수있는) 건조 콜라겐 코팅 된 세포 배양 접시를 제거합니다.
  4. 4 ℃에서 predigested 마음을 포함하는 원뿔 튜브를 제거 조직의 조각 (그림 1G)을 집계해야합니다. 조직 단편에 싱크하자튜브의 바닥 (모든 조직의 조각을 느슨하게하지 않도록하십시오., 일반적으로, 절연 매체의 약 1 ㎖ 튜브에 남아있을 수 있습니다) 뜨는을 제거합니다. 소화 배지 5 ㎖를 1 분 동안 산소 또는 공기를 이용하여 조직 절편 및 옥시 현탁액에 20mM의​​ BDM 보충 된 L-15 5 mL를 추가.
  5. 소화 용액의 온도를 조절하기 위해 약 2 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 소화 매체에서 심장 조직의 조각을 포함하는 밀봉 원뿔 튜브를 전송합니다.
  6. 20 ~ 30 분 동안 교반과 (60RPM 이하 이상으로 설정 37 ° C에서 예를 들어, 셰이커,)와 37 ° C에서 심장 조직의 조각을 품어. . 소화 시간은 크게 효소 혼합물 및 로트 번호주의에 따라 달라질 수 있습니다 : 더 이상 부화 기간 이상 효소의 농도는 세포 생존 능력을 감소시킬 수있다.

기술 코멘트 : 102696 : 우리는 (Cat.No. 로슈에서 콜라게나 / 디스 파제 혼합물의 사용을 추천합니다38001)이 아주 작은 로트의 변화가 있습니다. 마우스 심근의 분리를위한 고전적인 효소 트립신 및 / 또는 워딩 턴 (고양이 없음 CLS-2)에서 사용 가능한 콜라게나 제 II 형 3,16-20입니다. 그러나, 콜라게나 II의 성능은 로트에서 실질적으로 다를 수 있습니다. 워딩 턴은 일반적으로 소화 시간을 최적화하고 사용을 효소 몇 가지 콜라게나 많이 테스트 할 수 있습니다. 대안 적으로, 워딩은 사전 테스트 효소 혼합물로 심근 분리 키트를 판매하고 그 마우스 심장 근세포 17 (: NCIS 카탈로그 번호)의 분리를 위해 적응 될 수있다 포함.

  1. 신선한 멸균 50 ML 원뿔 팔콘 튜브에 멸균 세포 스트레이너 (40 ~ 100 μm의 나일론 메쉬)를 놓습니다. 20 mM의 BDM 보충 5 ㎖의 L-15와 사전 젖은 셀 스트레이너. 10 ~ 20 회 미리 침수 10 ㎖ 세포 배양 피펫을 사용하여 부드럽게 씹다 조직 조각. 조직 단편을 주로 suspensio로 세포를 방출이 단계 중에 분산해야N (그림 1H).
  2. 큰 조직 파편이 침전하자 세포 스트레이너 (그림 1I)를 통해 신선한 원뿔 튜브에 중단 세포를 포함 뜨는 전송.
  3. 5 ㎖의 소화 매체에 소화되지 않은 조직의 조각을 다시하면 일시 중지 및 교반과 함께 37 ° C에서 추가로 5 ~ 10 분 동안 품어.
  4. 남아있는 조직 조각의 지속적인 소화 한 후, 가볍게 10 ~ 20 회 조직을 씹다 첫 번째 셀 스트레이너를 통해 다이제스트에서 원뿔 튜브 포함하는 셀을 추가 할 수 있습니다. 모든 소화 세포의 통과를 허용하는 20 mM의 BDM 보충 5 ㎖의 L-15 세포 스트레이너를 씻어.
  5. Centrifugate 원뿔 튜브 300 rpm에서 5 분 (약 50 ~ 100 XG)에 대한 중단 심근을 포함. (대부분 섬유 아 세포와 내피 세포를 포함) 상층 액을 제거하고 매체를 도금 10 ㎖에 다시 중단 세포 펠릿.
  6. 10cm의 세포 배양 접시 (그림 2A)로 1 부화 플레이트 세포세포 배양 인큐베이터에서 -3의 시간. 이 사전 도금 단계는 코팅되지 않은 세포 배양 접시 (그림 2C)에 부착되는 섬유 아세포와 혈관 내피 세포 (그림 2B)를 제거합니다.
  7. 배양 후, 전송 재현 탁 세포는 멸균 원뿔 팔콘 원심 분리 관 (15 ㎖를 50 ㎖)에 (반복 접시 위에 도금 매체를 피펫으로 다시 중단 세포) 10cm 배양 접시에서 비 부착 심근을 씻어.
    선택 사항 : 세포 현탁액에서 추가 섬유 아 세포를 제거하는 사전 도금 단계를 반복합니다. 필요하다면, 접착 섬유 아세포 및 내피 세포 배양 일 수있다.
  8. (노이 바 우어의 혈구를 사용하여 예를 들어, 21를 염색 블루 배제 트리 판) 세포를 계산합니다.
  9. cm 2 (그림 2D 당 약 1.5 × 10 5 세포의 밀도 콜라겐 코팅 된 세포 배양 접시에 플레이트 세포, 볼은 도금 표 1 코멘트및 코팅).
    세포 배양 인큐베이터에 요리를 놓고 준수 및 심근의 확산 수 있도록 12 ~ 18 시간 동안 그대로 둡니다.

3 일 - 신생아 심근의 문화

  1. 37 ° C의 물을 욕조에 유지 보수 매체 prewarm를 준비합니다. 신생아 마우스 심근의 리포좀 형질에 대한 증식 억제 또는 chronotropic 에이전트의 추가, 또는 절차에 대한 내용은 표 1을 참조하십시오.
  2. 어느 날 도금 후 심근 세포의 배양 접시에 부착하고 최적의 계약을 자발적으로 시작해야합니다 (그림 2E, 2F를, 보충 영화 S2; 분리 / 배양 절차를 수행하는 동안 일반적인 문제에 대한 표 2 참조). 추가 1-5일에 대한 유지 보수 매체와 문화 매체를 도금 교체합니다. 필요에 따라 매체를 변경합니다.

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결과

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 8 햇 신생아 생쥐 (그림 1A, 1B, 보충 영화 S1)에서 마음입니다. 세척 및 가위 (그림 1C-1 층)과 마음을 닦지 후, 조직 단편을 교반과 함께 4 ° C에서 밤새 절연 매체에 predigested했다. predigestion (그림 1G)에 따라, 우리는 갓 소화 매체로 조직 조각을 전송하고, 교반과 함께 37 ° C에서 20 분 동안 조직의 조각을 배양 하였다. 얻어진 세포 ?...

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토론

심장 질환을 연구하는 동물 모델의 사용은 심장 혈관 연구에서 표준이되었습니다. 이 모델의 가까이 생화학 적 특성 (즉, 생화학 적 또는 생체 역학적 인 자극에 심장 세포의 직접 응답을 공부)은 일반적으로 심장 조직이나 심근의 분리가 필요합니다. 심장의 생리적 반응을 조사 연구는 생체 (예를 들어 40 아세틸 콜린, 또는 허혈 - 재관류 시나리오 41)은 일반적으로 ?...

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공개

없음.

감사의 말

우리는 교수의 명예 장 클로드 Perriard과 에블린 Perriard 신생아 쥐와 쥐 심근을위한 절연 기술에 도입 (기술, 스위스 스위스 연방 공업 대학)에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 그들의 지원을 위해 교수 후아 첸 교수 실비아 에반스 (UCSD, 미국)에게 감사의 말씀을 전합니다. EE의 실험실에서 작업 MRC 경력 설립 교부금에 의해 투자되었다. SL은 NIH / NHLBI (HL107744)에서 독립 수상에 K99/R00 경로에 의해 지원된다. TMM은 미국 심장 협회 (American Heart Association, 11POST7310066)에서 박사 학위 취득 후 친교에 의해 지원되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8SigmaB-0753prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/DispaseRoche10269638001can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3WorthingtonCLS-2substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTAcellgro25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSScellgro30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)e,g, cellgro21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4cellgro21-022-CV
DMEM high glucosecellgro10-013-CV
M-199cellgro10-060-CV
fetal bovine serumcellgro35-011-CVcell-culture grade
horse serumcellgro35-030-CVcell-culture grade
Leibovitz L-155cellgro10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)SigmaC-6645proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrineSigmaP-6126chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochlorideSigmaI-6501chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solutionSigmaC-8919extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solutionAdvanced BioMatrix5005-Balternative to Sigma collagen solution
cell strainerFisherbrand22363548appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μmFisherbrand09-719Cfor sterile filtration of digestion medium
straight scissorsFine Sciences Tools91460-11
curved scissorsFine Science Tools91461-11
Dumont No. 7 forcepsFine Science Tools91197-00
perforated spoonFine Science Tools10370-19optional, for transfer of heart tissue
Trypan blueGibco15250-061live cell staining
Neubauer hemocytometerProsource Scientific3500alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubesFisherbrand14-432-23
15 ml Falcon tubesFisherbrand05-527-90
20 ml syringeBD Medical14-820-19
10 ml serological pipetteFalcon357551
30 mm cell culture dishNunc153066for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottomMatTekP35G-0-10-Cfor live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dishNunc172958for preplating
Escort IIISigmaL3037for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000Life Technologies, Invitrogen52887substitute for Escort III
Buffers and media:
  • Isolation medium (filter sterilize)
    20 mM BDM
    0.0125% trypsin
    in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)
  • Digestion medium (filter sterilize)
    20 mM BDM
    1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix
    in L15 medium
  • Plating medium
    65% DMEM high glucose
    19% M-199
    10% horse serum
    5% fetal calf serum
    1% penicillin/streptomycin
  • Maintenance medium
    78% DMEM high glucose
    17% M-199
    4% horse serum
    1% penicillin/streptomycin
    optional:
    1 μM AraC
    1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine
The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.

참고문헌

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