Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Riepilogo

Culture del mouse cardiomiociti primari sono uno degli strumenti cardine per l'indagine di organizzazione e la funzione miofibrillare. Il protocollo che segue descrive l'isolamento e la coltura di cardiomiociti primari di cuori neonatali mouse. Le risultanti colture di cardiomiociti possono successivamente essere utilizzati per una varietà di biomeccanici, saggi biochimici e cellule biologiche.

Abstract

Cardiomiociti neonatali in coltura sono stati a lungo utilizzati per studiare myofibrillogenesis e le funzioni miofibrillari. Cardiomiociti in coltura consentono una facile ricerca e manipolazione di vie biochimiche, e il loro effetto sulle proprietà biomeccaniche di battere spontaneamente cardiomiociti.

Il protocollo 2-giorno seguente descrive l'isolamento e la coltura di cardiomiociti neonatali di topo. Mostriamo come sezionare facilmente cuore da neonati, dissociare il tessuto cardiaco e arricchire cardiomiociti dalle cellule popolazione cardiaca. Discutiamo l'utilizzo di diversi mix di enzimi per la cella-dissociazione, e dei loro effetti sulla cellula-vitalità. I cardiomiociti isolati possono essere successivamente utilizzati per una varietà di,,, saggi di cellule biologiche o biomeccanica biochimici elettrofisiologici morfologiche. Abbiamo ottimizzato il protocollo per robustezza e riproducibilità, utilizzando solo soluzioni disponibili in commercio e l'enzima mix che shpoca variabilità ow lotto a lotto. Ci rivolgiamo anche a problemi comuni associati con l'isolamento e la coltura di cardiomiociti, e di offrire una varietà di opzioni per l'ottimizzazione delle condizioni di isolamento e coltura.

Introduzione

Le prime relazioni per la dissociazione di successo e coltura di cellule cardiache del roditore risale al 1960 ^1,2. Anche allora, Harary e Farley notato che cardiomiociti in coltura "possono fornire un sistema unico per lo studio dei requisiti della contrattilità periodica [e possono] fornire un mezzo per determinare il contributo dei vari percorsi metabolici per la [battito] processo". Anche se Harary e Farley cardiomiociti isolati e coltivati ​​da giovani ratti, e il protocollo originale è stato adattato e modificato da molti scienziati nel corso degli anni, la procedura generale isolamento e la coltura non è molto cambiata. Tuttavia, enzimi migliori ^3, soluzioni standardizzate ^4,5, e l'aggiunta del canale reversibile e miosina ATPasi inibitore BDM per proteggere le cellule durante la procedura di isolamento ^6-9 è migliorata significativamente cellula-resa e la fattibilità.

Adulto vs cardiomiopatia neonataleciti

Cardiomiociti isolati e coltivati ​​da topi o ratti neonati hanno diversi vantaggi rispetto colture di cardiomiociti adulti. Primo, la procedura di isolamento di topo o ratto cuori neonatali è più semplice e meno costosa, rispetto all'isolamento di cardiomiociti di topo adulto o ratto ^10. Cardiomiociti neonatali sono molto meno sensibili alle reintroduzione in un mezzo contenente calcio dopo dissociazione, aumentando notevolmente cella rendimento. Un altro grande vantaggio è che i cardiomiociti neonatali di topo subiscono una più rapida de-differenziazione - ciclo ridifferenziazione che di solito si traduce in modo spontaneo battere cellule 20 ore dopo la placcatura, mentre cardiomiociti adulti in genere richiedono stimolazione per indurre la contrazione. Cardiomiociti neonatali sono anche più facilmente transfectable con i metodi liposomiale trasfezione, considerando che i cardiomiociti adulti necessitano di vettori virali per la consegna di successo di DNA transgenico. In contrasto con cardiomiociti neonatalis, la cultura dei cardiomiociti roditori adulti ^11-13 consente di ricerche di degradazione miofibrillare ed eventuale ripristino dell'apparato contrattile. Questi cambiamenti morfologici caratteristici cardiomiociti adulti avvengono su periodi di 1-2 settimane. Il dedifferentiation - ciclo ridifferenziazione è accompagnata da reexpression del programma gene fetale, imitando in tal modo i cambiamenti patologici osservati in cardiomiopatie umani ^14. Un altro vantaggio di cardiomiociti di ratto adulto di coltura di cardiomiociti neonatali è la capacità di coltura queste cellule per lunghi periodi di tempo.

Rat vs cardiomiociti di topo

L'isolamento e la coltura di cardiomiociti neonatali di ratto ha alcuni vantaggi rispetto quella del topo cardiomiociti neonatali, compresi rendimenti più elevati di cellule vitali e un aumento dei tassi di trasfezione. Tuttavia, l'ampio utilizzo di modelli murini geneticamente modificati per le malattie cardiache (es. </ Em> il lim muscolo topo knockout proteine ​​come modello per la cardiomiopatia dilatativa ¹⁵⁾ ha portato alla adeguamento della procedura di isolamento di cardiomiociti derivati ​​da topi neonati. Sebbene i protocolli utilizzati per isolare neonatali di ratto e di topo cardiomiociti sono quasi identiche, una maggiore attenzione deve essere posta nella scelta di un mix enzima appropriato per quest'ultimo. Infatti, cardiomiociti neonatali di topo sono generalmente più suscettibili a overdigestion, risultante in una cella rendimento e ridotta vitalità. Inoltre, la densità di placcatura deve essere regolata, perché cardiomiociti derivati ​​da topi neonati sono più piccole rispetto alle cellule derivate da cuori di ratto neonatale.

Con molti usi per le indagini, parametri morfologici, elettrofisiologici, biochimici cellulari-biologica e biomeccanica nonché per il processo di myofibrillogenesis, cardiomiociti neonatali coltivate sono diventati uno dei sistemi più versatili per lo studio difunzioni delle cellule cardiache in vitro. Il primo passo per un saggio di successo però, dipende da una metodologia semplice e affidabile per isolare i cardiomiociti neonatali di topo. Il nostro protocollo trae metodologia da molte fonti e stato ottimizzato per la riproducibilità e robustezza. Discutiamo fattori che influenzano cardiomyocyte rendimento e la redditività, e di fornire una varietà di opzioni per l'ottimizzazione delle condizioni di isolamento e coltura.

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Protocollo

La procedura seguente descrive un protocollo ^16,17 di due giorni per l'isolamento e la cultura dei cardiomiociti neonatali di topo. Tutte le soluzioni sono sterili o sterili filtrata. Tutti gli strumenti sono sterilizzati mediante sterilizzazione superficie con il 75% di etanolo. Tranne per l'estrazione del tessuto iniziale, tutte le fasi vengono eseguite in una cappa di coltura cellulare a flusso laminare sterile. Questo protocollo è destinato per l'isolamento di cuori neonatali di topo 1-2 cucciolata (s) - circa 5-14 cuccioli, ma può essere adattato per dimensioni dei cuccioli più grandi e cardiomiociti neonatali di ratto. L'utilizzo di supporti Scala / enzima come appropriato.

Per il lavoro con i roditori neonatali, consultare le linee guida universitari locali e le regole stabilite dal legislatore e / o programmi di cura degli animali, e di aderire al vostro protocollo animali istituzionalmente approvato. Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dalla Institutional Animal Care ed uso commissione UC San Diego (IACUC), e di aderire alla fedenormative ral e statali.

Giorno 1.

1. Isolamento di tessuto cardiaco da topi neonati

1. Preparare 50 ml di PBS 1x (senza Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +)} supplementato con 20 BDM mM ^6-8, e disperdere in due piatti sterili batteriche immessi sul ghiaccio.
2. Preparare 10 ml di terreno di isolamento in 50 ml sterile tubo Falcon conica. Conservare tutte le soluzioni su ghiaccio. Sterilizzare le forbici (una curva, una retta), e pinze (curve, Dumont No.7).
3. 1-3 giorni vecchi topi neonati sono sciacquati rapidamente in una soluzione di etanolo al 75% per la sterilizzazione di superficie. I cuccioli vengono decapitati con forbici sterili (diritti), e il torace si apre lungo lo sterno per consentire l'accesso alla cavità toracica e il cuore (Figura 1A, Supplemental Movie S1).
   Commento tecnico: topi neonati di età superiore ai tre giorni possono essere utilizzati, ma comportano un minor numero di cellule vitali ^2.
4. Cuori sono estratti dail corpo con forbici curve e trasferiti immediatamente nel piatto batterica contenente PBS 1x (senza Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +)} con 20 mM BDM, su ghiaccio. Tutte le fasi sono eseguite nella cappa coltura cellulare sterile.
5. Rimuovere il tessuto polmonare, navi più grandi (e atri, se lo si desidera). Lavare cuori nella soluzione 1x PBS (senza Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +)} con 20 BDM mm (su ghiaccio) per rimuovere il sangue. Trasferimento lavato cuori dal primo piatto al secondo piatto batterico contenente 1x PBS (senza Ca ^{2 +,} Mg ^{2 +)} con 20 BDM mm (su ghiaccio) con pinze o un mestolo forato (Figura 1B).
6. Cuori Transfer pulito / lavato in una goccia di terreno di isolamento (circa 250 microlitri; la figura 1C) in un terzo piatto batterica (su ghiaccio) e usare le forbici curve di sminuzzare i cuori in piccoli pezzi (circa 0,5-1 mm ^3, o più piccoli; Figura 1D, 1E).
7. Trasferire cuori tritati in una conicaprovetta contenente 10 ml di terreno di isolamento (su ghiaccio), e incubare con lieve agitazione a 4 ° C durante la notte.

Day 2.

2. Tissue digestione enzimatica e la placcatura delle cellule

1. Pesare 15 mg di collagenasi / dispasi miscela (Roche), e sciogliere la miscela enzimatica in 10 ml L15-medio ⁵ supplementato con 20 mM BDM (medium digestione). Filtro sterile il mezzo digestione nella cappa coltura cellulare in un nuovo tubo sterile 50 ml Falcon.
2. Preparare 30 ml L-15 supplementato con 20 mM BDM, e media placcatura.
3. Piastre Coat coltura cellulare con la soluzione di collagene (Sigma C-8919), per un minimo di 1 ora. Rimuovere la soluzione di collagene (può essere riutilizzato) e collagene rivestito a secco coltura cellulare piatti in cappa coltura cellulare a flusso laminare sterile.
4. Rimuovere il tubo conico contenente i cuori predigerito da 4 ° C. Frammenti di tessuto devono essere aggregati (Figura 1G). Lasciate che i frammenti di tessuto si depositanoil fondo del tubo e rimuovere il surnatante (assicurarsi di non perdere i frammenti di tessuto;. normalmente, circa 1 ml di terreno di isolamento possono restare nel tubo). Aggiungere 5 ml di terreno digestione e 5 ml di L-15 supplementato con 20 BDM mM di frammenti di tessuto e le sospensioni ossigenare con ossigeno o aria per 1 min.
5. Trasferire il tubo conico sigillata contenente i frammenti di tessuto cardiaco in mezzo digestione a 37 ° C a bagnomaria per circa 2 min per regolare la temperatura della soluzione digestione.
6. Incubare frammenti di tessuto cardiaco a 37 ° C con agitazione delicata per 20-30 min (es shaker a 37 ° C, insieme a non più di 60rpm). Tempi di digestione possono dipenderà in gran miscela di enzimi e numero di lotto. Attenzione: periodi di incubazione più lunghi o concentrazioni enzimatiche più elevate possono ridurre la vitalità cellulare.

Commento tecnico: Si consiglia l'utilizzo di una miscela collagenasi / dispasi da Roche (art: 10269638001), che ha ben poca variabilità da lotto a lotto. L'enzima classica per l'isolamento di cardiomiociti di topo è tripsina e / o collagenasi di tipo II ^3,16-20 disponibile da Worthington (Cat n CLS-2). Tuttavia, le prestazioni di collagenasi II può differire sostanzialmente da lotto a lotto. Worthington consente in genere per la sperimentazione di diversi lotti di collagenasi per ottimizzare i tempi di digestione e l'enzima utilizzo. In alternativa, Worthington vende un kit di isolamento cardiomiociti con una miscela di enzimi pre-testati inclusi che possono essere adattate per l'isolamento di cardiomiociti di topo ¹⁷ (Cat. No.: NCIS).

7. Posizionare sterile cell-filtro (40-100 micron maglia di nylon) in freschi sterile 50 ml tubo conico falco. Filtro cella di prelavaggio con 5 ml L-15 supplementato con 20 BDM mm. Frammenti di tessuto delicatamente triturare con un pre-bagnata 10 ml di coltura cellulare pipetta per circa 10-20 volte. I frammenti di tessuto devono principalmente disperdere durante questa fase, rilasciando le cellule in suspension (Figura 1H).
8. Lasciate frammenti di tessuto grandi sedimenti e surnatante trasferimento contenente cellule sospese in provetta conica attraverso la cella-filtro (Figura 1I).
9. Re-sospendere i frammenti di tessuto non digerito in 5 ml di mezzo la digestione e incubare per altri 5-10 minuti a 37 ° C con agitazione.
10. Dopo aver continuato digestione dei restanti frammenti di tessuto, triturare delicatamente il tessuto per 10-20 volte e aggiungere al tubo contenente cellule coniche dal primo digerire attraverso il filtro delle cellule. Risciacquare cellula-filtro con 5 ml L-15 supplementato con 20 mM BDM per consentire il passaggio di tutte le cellule digerite.
11. Provetta conica centrifugato contenente cardiomiociti sospensione per 5 min a 300 rpm (circa 50-100 xg). Rimuovere il surnatante (contenente principalmente fibroblasti e cellule endoteliali) e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di placcatura medie.
12. Celle a piastre in cella 10 cm piatto di coltura (Figura 2A) e incubare per 1-3 Ore in cella cultura incubatore. Questa fase di pre-placcatura rimuove fibroblasti e cellule endoteliali (Figura 2B), che aderirà al piatto coltura cellulare non patinata (Figura 2C).
13. Dopo l'incubazione, lavare i cardiomiociti non aderenti da 10 cm piatto cultura (ri-sospensione delle cellule pipettando ripetutamente il mezzo placcatura sopra il piatto), e le cellule risospese trasferimento ad una conica provetta Falcon da centrifuga sterile (15 ml o 50 ml).
    Facoltativo: Ripetere la fase di pre-plating per rimuovere i fibroblasti supplementari dalla cella-sospensione. Se lo si desidera, le cellule di fibroblasti ed endoteliali aderenti possono essere ulteriormente coltivate.
14. Contare le celle (ad esempio utilizzando emocitometro Neubauer, trypan esclusione colorazione blu ^21).
15. Celle a piastre in collagene rivestite piatti di coltura di cellule con una densità di circa 1,5 x 10 ⁵ cellule per cm ² (Figura 2D; vedi i commenti anche nella tabella 1 sulla placcaturae rivestimento).
    Mettere i piatti nella cella cultura incubatore e lasciare indisturbati per 12-18 ore per consentire l'aderenza e la diffusione dei cardiomiociti.

Giorno 3 - Cultura di cardiomiociti neonatali

1. Preparare terreno di mantenimento e Preriscaldare a 37 ° C bagnomaria. Fare riferimento alla Tabella 1 per l'aggiunta di inibitori di proliferazione o agenti cronotropi, o la procedura per la trasfezione liposomiale dei cardiomiociti neonatali di topo.
2. Un giorno, dopo la placcatura, cardiomiociti dovrebbero hanno aderito al piatto di coltura cellulare e in modo ottimale inizia spontaneamente a contrarsi (Figura 2E, 2F, lettera Movie S2, vedi Tabella 2 per i problemi più comuni durante la procedura di isolamento / cultura). Sostituire placcatura media con terreno di mantenimento, e la cultura per altri 1-5 giorni. Cambiare mezzo come necessario.

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Risultati

Usando questo protocollo, abbiamo isolato i cuori da 8 un giorno di età topi neonati (Figure 1A, 1B, Supplemental Movie S1). Dopo il lavaggio e macinazione i cuori con le forbici (Figure 1C-1F), frammenti di tessuto sono stati predigerito in terreno di isolamento per tutta la notte a 4 ° C con agitazione. Dopo predigestione (Figura 1G), abbiamo trasferito i frammenti di tessuto in mezzo digestione appena fatto, e incubate i frammenti di tessuto per 20 min a 37 ° C co...

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Discussione

L'uso di modelli animali per studiare le malattie cardiache è diventato standard nella ricerca cardiovascolare. Caratterizzazione Closer biochimica di questi modelli (ovvero studiando risposte dirette su cellule cardiache a stimoli biochimici e biomeccanici) richiede in genere l'isolamento dei tessuti cardiaci o cardiomiociti. Gli studi che indagano risposte fisiologiche del cuore ex vivo (ad esempio dell'acetilcolina ^40, o in scenari ischemia-riperfusione ⁴¹⁾ general...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	cellgro	10-013-CV
M-199	cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	Falcon	357551
30 mm cell culture dish	Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.