新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

要約

初代マウス心筋細胞培養は、筋原線維組織や機能の調査のための極めて重要なツールの一つである。以下のプロトコルは、新生児マウスの心臓から初代心筋細胞の単離および培養について説明します。得られた心筋細胞培養物は、続いて、生体力学的、生化学的および細胞生物学の種々のアッセイに使用することができる。

要約

培養された新生児の心筋細胞は、長いmyofibrillogenesisと筋原線維の機能を研究するために使用されてきた。培養心筋簡単な調査と操作生化学的経路の、そして自然に心筋細胞を破っての生体力学的特性に及ぼす影響を考慮。

次の2日間のプロトコルは、新生児マウスの心筋細胞の単離および培養について説明します。我々は簡単に、新生児の心臓を解剖心臓組織を解離し、心臓の細胞集団から心筋細胞を豊かにする方法を示しています。我々は、細胞分離のために異なる酵素混合物の使用、および細胞生存性に与える影響を議論。孤立した心筋細胞は、その後、形態的、電気生理学的、生化学的、細胞生物学的または生体力学的検定のさまざまな目的で使用することができます。私たちは、商業的に利用可能なソリューションを使用することにより、堅牢性と再現性のためのプロトコルを最適化し、酵素がそのSHをミックスOW少しロット間変動。また、心筋細胞の単離および培養に関連する一般的な問題に対処し、単離および培養条件の最適化のためのさまざまなオプションを提供します。

概要

げっ歯類の心臓細胞の正常な解離と文化のための最も初期の報告は、1960年の^1,2にさかのぼります。それでも、ハラリィとファーリーは培養心筋細胞は「定期収縮の要件の研究のためのユニークなシステムを提供することができ、[、とあり] [鼓動]プロセスのための様々な代謝経路の寄与を決定する手段を提供する」ことに気づいた。幼若ラット、元のプロトコルからハラリィとファーリー単離し、培養心筋細胞は、長年にわたって適応し、多くの科学者によって変更されているが、一般的な単離·培養手順が大幅に変更されていません。しかし、より良い酵素^3、標準化されたソリューションを^4,5、および単離手順^6-9の間に細胞を保護する可逆チャンネルとミオシンATPアーゼ阻害剤BDMの添加は、細胞収量及び生存率を改善した。

新生児cardiomyo対アダルトcytes

新生児マウスまたはラットから単離し、培養心筋細胞は、成人の心筋細胞の培養液に比べていくつかの利点がある。成体マウスまたはラット¹⁰から心筋細胞の単離と比較した場合、まず、新生仔マウスまたはラットの心臓の分離手順は、簡単かつ低コストである。新生児心筋細胞が大幅に細胞収量を増加させる、解離後のカルシウム含有培地中に再導入するためにはるかに敏感である。大人の心筋細胞は、通常、収縮を誘発するためにペーシングが必要ですが、一般的に、めっき後自発的に拍動細胞では20時間後に、その結​​果、再分化サイクル - もう一つの大きな利点は、新生児マウスの心筋細胞は、より迅速な脱分化を受けることである。新生児の心筋細胞は、成人の心筋細胞は、トランスジェニックDNAの正常な配信のためのウイルスベクターを必要とするのに対して、より容易に、リポソームトランスフェクション法でトランスフェでもある。新生児心筋細胞とは対照的にS、成人の齧歯類心筋細胞^11〜13の文化は、筋原線維の劣化と収縮装置の最終的な再構築の検討が可能になります。成人の心筋細胞におけるこれらの特徴的な形態変化は、1〜2週間の期間にわたって発生する。脱分化-再分化サイクルは、それによって人間の心筋症¹⁴で観察された病理学的変化を模倣し、胎児の遺伝子プログラムの再発現を伴う。新生児の心筋細胞を培養上の大人のラットの心筋細胞のもう一つの利点は、長期間培養することができることは、これらの細胞である。

マウスの心筋細胞対ラット

ラット新生児心筋細胞の単離および培養は、生細胞のより高い収量の増加、トランスフェクション率を含むマウス新​​生児の心筋細胞のそれ以上のいくつかの利点があります。しかし、心疾患のため、遺伝子組み換えマウスモデルの幅広い使用方法（ 例えば、</ em>は拡張型心筋症¹⁵のモデルとして筋肉LIMタンパク質ノックアウトマウス）は、新生児マウス由来の心筋細胞の分離手順の適応につながっている。新生ラットとマウスの心筋細胞を分離するために使用されるプロトコルは、ほとんど同じですが、より大きな注意が、後者のための適切な酵素ミックスの選択に注意する必要があります。実際、新生児マウスの心筋細胞は、減少した細胞収量および生存度で、その結果、一般的には過剰消化を受けやすい。新生仔マウス由来の心筋細胞が新生児ラット心臓由来の細胞と比較してやや小さいのでさらに、播種密度は、調整されるべきである。

形態的、電気生理学的、生化学的、細胞生物学的および生体力学的パラメータだけでなく、myofibrillogenesisのプロセスのための調査のための多くの用途で、培養された新生児心筋細胞の研究のための最も汎用的なシステムの一つとなっているin vitroでの心臓細胞の機能。成功した検定への第一歩は、しかし、新生児マウスの心筋細胞を分離するための簡単​​で信頼性の高い方法論に依存します。我々のプロトコルは、多くのソースから、その方法論を引き出し、再現性と堅牢性のために最適化された。我々は心筋細胞の収率および生存率に影響を与える要因について議論し、単離および培養条件の最適化のためのさまざまなオプションを提供しています。

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プロトコル

次の手順では、新生児マウスの心筋細胞の単離および培養のための2日間のプロトコル^16,17について説明^します。すべてのソリューションは、無菌または滅菌濾過される。すべてのツールは、75％エタノールで表面殺菌により滅菌されています。初期の組織摘出を除き、全ての工程を無菌層流細胞培養フード内で行っている。このプロトコルは、ワンツーごみ（S）からの新生児マウス心臓を単離するためのものです - 約5から14匹が、より大きなゴミサイズとラット新生児心筋細胞に適合させることができる。必要に応じて、スケールのメディア/酵素の使用量。

新生児げっ歯類での作業のために、立法府および/または動物のケアプログラムで定められた、あなたの地元の大学のガイドラインやルールを参照し、お使いの制度的に承認動物プロトコルに準拠しています。このプロトコルで説明されているすべてのメソッドは、カリフォルニア州立大学サンディ​​エゴ校の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、FEDEに付着されていますRALおよび州の規制。

1日目。

1。新生児マウスからの心臓組織の単離

1. 20 mMのBDM ^6-8で補充（Ca ^{2 +や} Mg ^{2 +}を含まない）×PBS中の50ミリリットルを用意し、氷の上に配置された2つの滅菌細菌皿に分散させる。
2. 50ミリリットルの滅菌コニカルファルコンチューブに分離培地10mlを準備します。氷の上のすべてのソリューションを保管してください。 、鉗子（湾曲し、デュモン7号）、はさみ（1ストレート湾曲した1）を殺菌する。
3. 1-3日齢の新生仔マウスは、表面殺菌し、75％エタノール溶液中で速やかにリンスする。子犬は、滅菌ハサミ（ストレート）を使用して断頭し、胸は胸腔へのアクセスと心臓（ 図1A、補足ムービーS1）を可能にするために胸骨に沿って開かれる。
   技術的なコメント：3日以上経過した新生マウスを使っていますが、少数の生存細胞²になることがあります。
4. 心臓から抽出され湾曲したハサミでボディと氷の上で、20 mMのBDMと（Ca ^{2 +や} Mg ^{2 +}を含まない）1X PBSを含む細菌皿にすぐに移す。以下のすべての工程を無菌細胞培養フード内で行っている。
5. （必要に応じて、心房）肺組織、より大きな血管を削除します。血液を除去するために20 mMのBDM（氷上）と（Ca ^{2 +や} Mg ^{2 +}を含まない）1×PBS溶液中での洗浄の心。転送は、鉗子や穴あきスプーン（ 図1B）を使用して、20 mMのBDM（氷上）と（Ca ^{2 +や} Mg ^{2 +}を含まない）1X PBSを含む第二の細菌皿に一皿から心を洗浄した。
6. （氷上で）第三の細菌皿に、約0.5〜1ミリメートル^3、以下（小さ ​​な断片に心をミンチする湾曲したハサミを使って、転送分離培地のドロップに心（ 図1C、約250μl）を洗浄/洗浄; 図1D、1E）。
7. 円錐形に刻んだ心を移すチューブは（氷上で）分離培地10mlを含む、一晩4℃で穏やかに攪拌しながらインキュベートする。

2日目。

2。細胞の酵素組織消化とめっき

1. コラゲナーゼ/ディスパーゼ混合物（Roche）を15mgのを計量し、20 mMのBDM（消化培地）を補充した10ミリリットルL15-媒体⁵に酵素ミックスを溶かす。無菌フィルター新しい滅菌50ミリリットルファルコンチューブに細胞培養フード内消化培地。
2. 20 mMのBDMを補足した30ミリリットルのL-15培地を調製し、培地をメッキする。
3. 1時間の最小のコラーゲン溶液（Sigma C-8919）で被覆細胞培養プレート。無菌層流細胞培養フード内でコラーゲン溶液（再利用することができます）と乾燥コラーゲンコーティングした細胞培養皿を取り外します。
4. 4℃から前消化心を含む円錐管を削除組織片（ 図1G）に集約する必要があります。組織片はに沈むましょうチューブの底部と（いずれの組織片を失うことはないことを確認してください。通常、分離培地の約1ミリリットルは、チューブ内に残っている場合があります）、上清を除去します。消化培地5mlで1分間、酸素または空気を用いて組織フラグメントおよび含酸素化合物の懸濁液に20mMのBDMを補充したL-15を5ml加える。
5. 消化溶液の温度を調整するために約2分間37℃の水浴に消化培地中に心臓組織断片を含有する密封された円錐管に移す。
6. 20〜30分（60RPM超えないように設定して37℃、で例えばシェーカー）穏やかに撹拌しながら37℃で心臓組織片をインキュベートする。消化時間が大幅に酵素混合物、ロット番号に依存し得る注意：インキュベーション時間を長く又はより高い酵素濃度は、細胞生存率を減少させることができる。

技術的なコメント：102696：我々は（カタログ番号ロシュからコラゲナーゼ/ディスパーゼ混合物の使用をお勧めします38001）非常に少ないロット間のばらつきを有している。マウス心筋細胞の単離のための古典的な酵素は、トリプシンおよび/ ​​またはワージントン（カタログ番号CLS-2）から利用可能なコラゲナーゼII型^3,16-20です。しかし、コラゲナーゼIIの性能は、ロット間で大きく異なる可能性があります。ワーシントンは、一般的に消化時間を最適化し、使用量を酵素には、いくつかのコラゲナーゼロットのテストが可能になります。あるいは、ワージントンは、予め試験した酵素混合物を用いて心筋細胞単離キットを販売することは、マウス心筋細胞の単離^17（：NCISカタログ番号）に適合させることができる含まれる。

7. 新しい滅菌50mlコニカルファルコンチューブに無菌細胞ストレーナー（40〜100ミクロンのナイロンメッシュ）を配置します。 20 mMのBDMを補足した5ミリリットルのL-15で予め湿らセルストレーナー。約10〜20回予め湿らせた10ミリリットルの細胞培養ピペットを用いて穏やかに磨砕組織断片。組織片は、ほとんどサスペンシオに細胞を放出し、このステップの間に分散​​させる必要がありますN（ 図1H）。
8. より大きな組織片が沈降しましょおよび細胞ストレーナー（ 図1I）を介して新鮮なコニカルチューブに懸濁した細胞を含む上清を移す。
9. 5ミリリットルの消化培地中で未消化の組織片を再することは、一時停止し、穏やかに攪拌しながら37℃でさらに5〜10分間インキュベートする。
10. 残りの組織片の継続的な消化した後、ゆっくりと10〜20倍のための組織を粉末化し、最初のセルストレーナーを通して消化物からの円錐管を含む細胞に加える。すべての消化細胞の通過を可能にするために20 mMのBDMを補足した5ミリリットルのL-15で細胞ストレーナーを洗浄します。
11. 300回転（約50〜100×g）で5分間中断した心筋細胞を含む遠心分離コニカルチューブ。 （主に線維芽細胞および内皮細胞を含む）上清を除去し、培地をめっきする10ミリリットル中に再懸濁細胞ペレット。
12. 板細胞を10cmの細胞培養皿（ 図2A）へと1インキュベート細胞培養インキュベーター中で-3時間。このプレめっき工程は、コーティングされていない細胞培養皿（ 図2C）に付着した線維芽細胞及び内皮細胞（ 図2B）を除去する。
13. インキュベーション後、転送再懸濁した細胞を無菌の円錐形のFalcon遠心分離管（15 mlまたは50ml）中に（繰り返し皿上にプレーティング培地をピペッティングして再懸濁細胞）を10cm培養皿から非付着性心筋細胞を洗浄し、そして。
    オプション：細胞懸濁液から、追加の線維芽細胞を除去するためのめっき前の手順を繰り返します。所望であれば、接着性線維芽細胞および内皮細胞をさらに培養することができる。
14. （ノイバウエル血球計数器、パンブルー排除染色^21を使用することによって）細胞を数える。
15. 1cm ²当たり約1.5×10 ⁵細胞（ 図2Dの密度を有する、コラーゲンコートした細胞培養皿にプレート細胞;関連項目メッキの表1のコメントおよびコーティング）。
    細胞培養インキュベーターに料理を置き、付着および心筋細胞の拡散を可能にするために12から18時間静置しておきます。

3日目 - 新生児心筋細胞の培養

1. 37℃の水浴中で維持培地と予熱して調製する。新生児マウスの心筋細胞のリポソームトランスフェクションのための増殖阻害剤または変剤の添加、あるいは手続きについては、表1を参照してください。
2. ある日、めっき後に、心筋細胞は、細胞培養皿に接着し、最適縮小する自然発生的に開始している必要があります（ 図2E、2Fを 、 補足作品S2;分離/培養手順の間に一般的な問題については表2を参照してください）。追加の1-5日間、維持培地、および文化にメッキ培地を交換してください。必要に応じてメディアを変更します。

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結果

このプロトコルを使用して、我々は（ 図1A、1B、補足映画S1）8一日古い新生仔マウスからの心臓を単離した。洗濯やハサミ（ 図1C-1F）と心をミンチした後、組織片を穏やかに撹拌しながら4℃で一晩分離培地で予め消化された。前消化（ 図1G）に続いて、我々は新たに作製した消化培地に組織片を移して、穏やかに攪拌しながら37℃で20分間の組織片を培養...

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ディスカッション

心疾患を研究するための動物モデルを使用することは、心臓血管研究の標準となっている。クローサー（ すなわち 、生化学的または生体力学的刺激に心臓細胞の直接の反応を研究する）これらのモデルの生化学的特徴は、一般的に、心臓組織または心筋細胞の単離を必要とする。心の生理学的反応を調査した研究は、生体外 （ 例えば ^40をアセチルコリンに対す?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	cellgro	10-013-CV
M-199	cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	Falcon	357551
30 mm cell culture dish	Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.