量化的内皮细胞糖复合物的力学性能，用原子力显微镜

摘要

内皮糖萼的机械特性测定压痕使用AFM的悬臂上的微米大小的球体。内皮细胞培养在一个自定义的腔室，在生理流动条件下，诱导糖萼表达。使用薄膜的模型，以确定具有糖萼厚度和弹性模量的数据进行了分析。

摘要

我们理解白细胞捕获期间的白细胞与血管壁的相互作用的限制由内皮表面层的机械性能的一个不完整的理解。它是已知的非均匀分布的白细胞粘附分子相对于表面拓朴图^3，该地形限制粘结形成其他的表面^9，并且，生理上的接触力（≈5.0 - ：10.0，PN每微绒毛）可以为压缩的微绒毛少三分之一其休息的长度，增加分子的可访问性的相对表面^3，7。我们认为，血管内皮细胞的两层结构，相对刚性的单元主体，加上糖萼腔表面⁶上，一个软保护糖衣。它已被证明，糖复合物可以作为阻挡减少白细胞粘附于内皮表面^4。在这份报告中，我们着手解决的内皮细胞表面的变形，以了解血管内皮的机械刚度，可能会影响债券的形成。静态培养中生长的血管内皮细胞不表达一个强大的糖复合物，但在生理流动条件下生长的细胞开始观察体内的糖复合物。内皮细胞体的模量，已使用原子力显微镜（AFM）测定的，是大约5到20千帕^5。的糖复合物中的厚度和结构进行了研究，使用电子显微镜^8，和已糖复合物的模量的近似使用间接的方法，但就我们所知，没有已经发表在活细胞中的蛋白质复合物的弹性模量的直接测量的报告。在这项研究中，我们提出了一个新的原子力显微镜探针对细胞已培养的条件下，最大限度地发挥他们的糖被表达马压痕实验科的直接测量的弹性模量和厚度的内皮糖萼。

研究方案

1。方法

1.1细胞流动室

甲流室， 如图1中所示，构建了使细胞可为1.0帕（10达因/厘米^2）的剪切下生长，然后直接转移到一个的庇护MFP3D原子力显微镜（圣巴巴拉，加利福尼亚州）。

1. 流动室，制备实验首先通过清洗载玻片的Piranha溶液（3:1 H ₂ SO _{4：H 2 O 2）}为15分钟，然后用蒸馏水洗涤。然后将它们进行烘烤，以干燥和涂有氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）在真空沉积室中。
2. 有机硅垫片被切断使用剪影SD刀具的。这使我们能够精细地控制用于控制细胞的生长期间的流动速率和剪切应力的流动腔室的尺寸。通常情况下，一个信道被切断6.4毫米宽了19毫米，长为0.4mm的硅树脂的片材。的流量所需的属特1.0帕（10达因/厘米^2）的剪切应力的计算假设层流中的矩形通道与方程：

其中 Q是流率，τ是剪切应力，μ是介质的粘度，这里假定为1.0毫帕（0.01达因*秒/ cm ^2），h是高度和w是流动室的宽度。

3. 的流动腔室的顶部件对齐的垫圈中的细胞培养皿中，并与磁性环固定。该组件填充用异丙醇（IPA）进行灭菌。
4. 全流系统的组装。细胞培养皿中的流通口连接到三通阀。连接打开的阀门30ml注射器第IPA冲洗通过该系统，然后用4％的胎儿小牛血清（FCS）的McCoy的培养基用30ml洗涤。该系统，然后用20毫升的V​​EC技术细胞生长培养基填充。盖被放置在顶部的注射器。捕捞水库注射器的帽针在移动中储饲料。不育0.2μm的过滤器被安装在盖的进气口，以防止系统的污染。流动腔细胞接种的准备。

1.2细胞培养

1. 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和生长培养基购自VEC技术（伦斯勒，NY），并生长至汇合在T25药剂。
2. 除去生长培养基中，从烧瓶中，并用2毫升2.5％的胰蛋白酶释放的细胞单层。一旦细胞是在溶液中，向烧瓶中的细胞培养液中加入10毫升的胰蛋白酶消化，骤冷。
3. 钍E细胞悬浮液离心5分钟，并除去上清液。将细胞重新悬浮在1ml注入流动室的细胞培养基（含血清）。
4. 将细胞悬浮液（0.5毫升，约50,000个细胞）被加载到一个注射器中，并注入流动室通过一个三通阀。
5. 细胞被允许定居，并坚持到玻璃基板流开始前2小时。在细胞生长根据流的培养箱中在37℃，进行1〜5天，直到汇合。

1.3悬臂的制备和细胞压痕

1. 无针尖AFM的悬臂（纳米世界，瑞士）在硝酸中清洗5分钟，并用氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）在蒸镀室官能。
2. 5毫克/毫升（重量）NHS-磺基-LC-生物素的Hank缓冲盐溶液（HBSS）中制备的溶液。在悬臂被淹没在溶液中15分钟，以共轭门硅烷N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）化学。
3. VEC技术细胞培养介质（包括血清）的20毫升培养12小时streptavadin珠用200μl的溶液是由无生物素培养基中。在珠，用磁铁从培养基中除去，并通过0.22μm的无菌过滤器过滤介质。
4. 流动室除去从细胞培养皿中，并在37℃的无生物素培养基将细胞洗涤。
5. 1微升2.4μm的珠粒涂有链霉抗生物素蛋白在1ml无生物素培养基中的储备溶液制备，并加入100微升的股票的细胞培养皿中。
6. 链霉亲和素珠被拾起的悬臂通过登陆在玻璃表面上的胎圈，缩回旁边的前端，在胎圈定位在悬臂的先端，然后向下按压悬臂到胎圈和休息的几秒钟。
7. 在悬臂的时间测量的灵敏度d的缩进到裸露的玻璃的区域和使用的曲线的斜率设置作为电压的函数的尖端偏转。
8. 在悬臂的弹簧常数，然后计算热校准在MFP3D软件。
9. 然后将校准悬臂用于缩进的样品，如在图2中示出。这些2.4微米珠提供了一个较大的接触面积，使与细胞表面的软糖萼层的机械性能，可以检测。该悬臂被定位在附近的细胞核的细胞到细胞里的前端用来设置上方约3微米，在细胞表面的悬臂高度和柔软的方法。该软件被设置为20个重复的凹槽7 nN的一个最大的力为1μm/秒的速率。约6秒之间经过连续接触。这是可能使用不同速率的压痕测试的糖复合物的时间依赖特性，虽然在这些初始实验中，只有一个单一的压痕率（1微米/秒）被使用。

2。压痕理论

到的弹性半空间与半径为R的球中的压痕可以描述采用Hertz理论缩进的力，F由下式给出：

其中δ是压痕深度和 E *是根据测试（ 图3）的材料的弹性模量降低。以一个无限刚性的压头撞击均匀的弹性半空间的情况下，E *是由下式给出：

3/50163eq3.jpg“/>
其中 E是弹性模量，ν是材料的泊松比。与聚合物薄膜的最近的工作已激发用于确定的模量和厚度的薄膜¹的两个层模型的发展。我们应用此模型细胞生物学处理作为电池主体的表面上的均匀的薄的软膜糖萼。使用此模型中，该系统的模量的减少变为：

其中 ，E _GC是的蛋白质复合物的弹性模量，E _细胞的细胞体的模量，P，Q和n是已经凭经验确定从聚合物中配合， 而 z是由下式给出的常数：

其中 t是的蛋白质复合物层的厚度。这些参数的示意图如图3所示。该模型已被证明是更严厉的基板¹上的薄膜的弹性模量和厚度的确定一个准确的方法。这个方程可以使用，以适应从缩进到细胞得到的曲线，以确定的模量和厚度的内皮糖萼，如在图4中示出。

结果

在一个典型的实验中，从一个给定区域的细胞得到的20的力与距离曲线，通常在核周区域，靠近，但不包括在核（〜2μm的范围内）。曲线，考虑到对准测量的持续时间的任何样品漂移，然后取平均值，以除去悬臂噪音，如在图4中示出。曲线进行了分析和合适的被开发用于确定的弹性模量和厚度的薄的聚合物膜¹的两个层模型。从拟合的曲线的25个细胞中，我们已经确定，管腔?...

讨论

我们使用从两层模型和Hertz理论建模的循环血液中的白细胞与血管内皮壁的相互作用的计算出的值。我们计算一个微绒毛上与10 PN负载下的直径为50nm的白细胞会缩进约150nm到糖萼，只有一小部分的总厚度。这表明，糖复合物，与如在本实验中测得的性能，是一种显着的细胞 - 细胞相互作用的障碍，并可以是一个大的空间位阻的细胞期间必须克服的白细胞粘附的粘附级联期间。

?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂/材料名称	公司	目录编号	评论
麦考伊的中	Gibco公司	16600-082
胎牛血清	Hyclone公司	SH30070
血管内皮细胞生长培养基	血管内皮细胞技术	MCDB-131
汇集人类脐静脉内皮细胞	血管内皮细胞技术	PHUVEC/T-25
硫酸	JT贝克	9681-02
过氧化氢	VWR	BDH3742-1
（3 - 氨基丙基）三乙氧基硅烷	Aldrich公司	440140-100ML
异丙醇	VWR	BDH8999-4
胰蛋白酶	Cellgro	25-054-C1
汉克的缓冲盐溶液	Gibco公司	14175-095
磺基-NHS-LC-生物素	Thermo Scientific的	21335
Streptavadin珠	磁珠	112.06D
MFP-3D原子力显微镜	庇护研究
无针尖悬臂	纳米世界	ARROW-TL1-50
剪影SD	Quickutz	剪影-SD
硅橡胶	斯托克韦尔弹性体	SE50-RS
30毫升注射器	本顿迪金森	309650
18号针	本顿迪金森	305196
拓	Hospira公司	4429-48
4单向阀	泰利福	W21372
男/女港口上限	史密斯医疗	MX491B
蠕动泵	Watson-Marlow公司	401U / D
蠕动管	Watson-Marlow公司	903.0016.016
无菌过滤器	颇尔生命科学	4652