口头传播的<em&gt;单核细胞增生李斯特氏菌</em小鼠通过食入被污染的食物

摘要

本文介绍了一种新方法，口腔感染的小鼠使用单核细胞增生李斯特氏菌受污染的食物。该协议可以很容易地适应使用其他食源性细菌病原体。

摘要

单核细胞增生李斯特菌是兼性细胞内细菌病原体引起的食源性感染人类。很少有人知道有关胃肠阶段的李斯特菌病，由于缺乏一个小的，密切模仿人类疾病的动物模型。本文介绍了一种新型的小鼠模型，口头传播研究菌等 。利用这个模型，小鼠灌胃L.单核细胞增生李斯特菌污染的面包有一个独立的阶段，胃肠道感染，易感（BALB / C / J /通过）或抗（C57BL / 6）小鼠品系不同程度的全身蔓延。在感染的后期阶段，胆和脑的传播观察。食源性李斯特菌病模型是高度可重复性，并不需要专门的技能，可以用各种各样的细菌菌株和实验室小鼠品系。因此，它是理想的模型来研究两个致病策略由L.单核细胞增生

引言

单核细胞增生李斯特氏菌是兼性细胞内细菌病原体引起的食源性感染人类。细菌耐许多用来保护我们的食物供应，如干燥过程，腌制，或制冷^1,2和感染通常与处理，“准备吃”的食物，食用前没有加热。在以往一些爆发的来源L.单核细胞增生李斯特菌污染的食物经鉴定，受限制的组暴露个体密切监测^3-6。在这些例子中，其他健康人的变化从一个温和的，自限性胃肠炎的临床疾病，更严重的肠道感染和全身感染，需要住院治疗。L.已与菌感染在免疫系统受损的个人，包括新生儿和老年人，死亡率高（25-30％），即使使用抗生素治疗L.菌 ，或主机执政后对感染的易感性口头传播的因素，主要是由于缺乏一个小动物模型，概括这种大范围感染的结果。

李斯特菌病模型使用最广泛的是静脉注射（ⅳ）接种小鼠。 IV模型是高度重复性好，一直是非常有用的学习幼稚和记忆T细胞应答过程中感染^9,10。静脉模型的缺点是，它完全绕过肠道感染期。食物传播后，肠道粘膜提供一个屏障，它可能减慢和限制的数量的细菌，可以不断地传播到外周组织。相比之下，整个接种可以发现在脾和肝静脉给药后几分钟内，这个大丸有机体可能压倒先天的免疫Ð在这些组织efenses。口腔感染小鼠灌胃不常用，因为通常需要大剂量^（10 -10 ¹¹ CFU）实现肠道定植^10。此外，胃内（ig）可以与馈电针接种不产生可再现的期间全身扩散前的胃肠道感染。 研究报告说，一些实验室单核细胞增生达到脾脏和肝脏感染后4-12小时内（HPI），而其他人没有表现出全身扩散，直到48 HPI ^11-15。这个实验室到实验室的变异可能是灌胃接种侵入性的后果，这可能会导致轻微外伤的食道里，并直接促进血液入侵的细菌。

我们最近开发出一种新的小鼠模型口服L.单核细胞增生李斯特菌感染，密切模仿人类疾病的所有阶段^16。感染发生时，老鼠摄取件续氨化食品，是一个过程，非创伤性，并不需要专门的技能实验室调查。对于一个离散的一段时间（36-48小时），L。菌只重复殖民胃肠道，从而使致病性李斯特菌所使用的机制，转移整个肠道黏膜和传播外围组织调查。重要的是，该模型可用于研究在感染宿主固有电阻的差异。在先前的研究中，我们发现，通过/ J小鼠BALB / C /极易受到食源性李斯特菌病，指数复制L.发生菌在肠道，脾，肝，胆^16。相比之下，C57BL / 6小鼠耐食源性感染，只有短暂的殖民L.发生在每个这些组织中的单核细胞增生李斯特菌 。食源性，密切模仿人类疾病模型的另外一个特点是自然传播到大脑感染的后期阶段（5-7 dpi）的过程中发生。

研究方案

1。制备选择性琼脂培养基（BHI / L + G），以抑制肠道菌群

1. 称取26 g脑心浸液琼脂（Difco公司），7.5克氯化锂和5.0克甘氨酸，地点在1升烧瓶中。加入500毫升去离子水。
2. 热火在磁力搅拌器上直到琼脂沸腾，不断搅拌。烧瓶中，关火，让泡沫简要定居，然后再次带回烧开。
3. 高压灭菌30分钟，在121°C下16-19磅液体循环。 注意：离开搅拌棒的烧瓶中。
4. 平衡媒体55℃的水浴中或在室温放凉。不要让溶液温度超过55°C或晶体会形成在琼脂。该晶体不抑制L。单核细胞增生李斯特菌生长或影响选择性的媒体属性。然而，晶体将在外观上类似的小殖民地，将使其难以计数的细菌菌落形成单位。
5. 轻轻地混合琼脂，持续1分钟，用磁力搅拌器。避免形成气泡。琼脂倒入培养皿（〜25毫升/板）。
   注：该媒体不支持所有L.增长菌菌株。例如，L。菌 EGDE琼脂上生长良好，菌落36-48小时内可见，但10403s此媒体上不生长。

2。接种物的制备

1. 切成小切片白面包（克罗格）（2-3毫米）立方体用无菌剪刀ORA无菌手术刀刀片。不要使用结壳。单件存放在离心管在-20°C的感染，直到有一天。
2. 用消毒的手术刀，切成小块（0.5-1厘米）咸黄油（克罗格）块，并把每一个无菌的离心管。每根管子将包含足够的黄油准备50 - 60片面包。储存在-20°C，直到需要。
3. 成长L。 BHI肉汤菌摇晃30＆度;文化C，直到达到外径_{600〜0.8-1.0。}准备500微升等分离心管中，照顾旋涡样品频繁，所有的管子都包含同样数量的细菌。储存于-80℃。
4. 要滴度细菌等分，冰，解冻管，再加入500微升至9.5毫升BHI肉汤。在30℃下孵育1.5小时，站在板串行BHI琼脂稀释。期待的滴度为〜1-5×10 ⁸ CFU /毫升注：如果制备均匀的等分试样，可以期望每个管与方差的2至4倍时，以类似的方式制备，产率当前滴度。
5. 要感染小鼠，准备等分L.在步骤2.4中所描述的单核细胞增生李斯特菌 。大约20分钟前L.菌文化准备就绪后，在室温解冻的面包片。在55℃下熔体的等分试样，黄油和预温的​​一个小体积的PBS在55℃下准备足够的馒头片，以便有每只小鼠的至少一个被感染的至少一个用于确定实际的接种物的效价的多余碎片。
6. 预定细菌等分滴度的基础上，计算出的总体积为L。单核细胞增生李斯特菌培养需要准备所需数量的接种物为面包片。颗粒的细菌以14,000 xg离心10分钟，吸出所有BHI肉汤和悬浮预热的PBS（2微升/面包片）在小体积的细菌。
7. 涡融化的黄油，加入细菌（使用总体积等于3微升/面包片），调匀注意：不要试图在同一时间或黄油将巩固准备超过10-15馒头片。
8. 快速工作，吸取5μl到一个单一的面包片上的细菌悬浮离心管中。该解决方案应该被完全吸收的面包片。
9. 来确定实际的滴度接种物，加入1毫升的无菌PBS中的一个面包的piec的ES。涡大力为1分钟。准备系列稀释板都BHI BHI / L + G琼脂。
10. 高滴度（> 10 ⁹ CFU）接种的替代程序。如果将细菌沉淀过大时，它可以是困难的暂停，在这样一个小的体积，所得到的材料是很粘稠的，像糊状，一些接种物可能会粘到微量离心管的两侧。在这种情况下，最好是在无菌的60毫米培养皿中，接种面包，并提供整个天线（无盖），鼠标（见下文）。任何多余的接种物，然后，可以直接食用，不被吸收的面包由鼠标。一般来说，它需要更长的老鼠吃面包，舔干净的菜比下文所述的标准协议，所以这仅仅是处理非常高滴度接种时的首选方法。

3。小鼠感染

1. 购买雌性BALB / C / / J（股票＃0010026）和C57BL/6/J（股票＃000644）（巴港的杰克逊实验室，ME）和年龄在6-9周的使用。
2. 快速小鼠感染前一天（24小时），通过除去食品和升高的线（1英寸）的地板（第3目;阿伦敦），以防止食粪放置老鼠。只留下足够的床上用品吸收尿液在笼子里，但没有足够的提升棚粪便。允许不受限制地获得水。
3. 感染的小鼠在发病时的暗周期，在层流罩配备一个红色的灯泡工作。一个单一的鼠标转移到一个空笼（床上用品）。用无菌镊子，转移污染的面包片的空笼的底部。通常情况下，鼠标会拿起面包片，在2-10分钟内完全消耗。如果鼠标不马上吃面包，返回笼架离开鼠标静置20-30分钟。然而，在此时限内，大多数动物会吃面包，老鼠可以保持原状，没有进入加时赛她的食物或水可达2小时。
4. 感染后，鼠标将返回其原来的笼子里，并补充鼠标州城。继续以容纳老鼠提出电线地板上的实验的持续时间。

4。监控棚粪便中细菌水平

1. 出版商和预先称重的离心管，用于收集粪便。
2. 工作后迅速检索笼子里的老鼠，每只小鼠放置在一个500毫升的塑料烧杯。通常情况下，老鼠会在5分钟内驱逐1-4粪便颗粒。
3. 使用无菌镊子将粪便适当标记的试管。
4. 称量每个管和粪便的重量计算的重量减去空管。典型的粪便重量范围从10-30毫克。
5. 加入PBS，每管（200μl/30毫克屎），并用无菌牙签捣碎粪粒。
6. 每个涡管，持续30秒，然后准备在BHI / L的系列稀释液和板+ G琼脂。计数菌落数和计算CFU /毫克粪便。

5。处理感染肠组织

1. 安乐死的小鼠，无菌收获从每个鼠标的胃和肠道作为一个单一的组织和收集空100毫米培养皿。
2. 小肠，盲肠，结肠和地方在单独存储在冰60毫米的菜肴分开。可进一步分为小肠长度接近十二指肠，空肠，回肠，便于清除管腔内容分为三等分。组织三分之二然后一起处理（整个小肠的菌落形成单位）或分开。湿纸巾〜0.5毫升无菌PBS保持柔韧，防止处理过程中的眼泪。
3. 8毫升无菌PBS填充10毫升注射器，并附加25 G针。使用无菌镊子，肠腔内容物挤出成废物烧杯（或无菌如果收集管腔细菌）50毫升管。 FLUS小时4毫升PBS组织通过的一端，使用镊子挤压出来的内容，然后翻转组织的另一端重复。
4. 要量化肠腔内容物中李斯特菌的数量，以12,000 xg离心汇集20分钟刷新，暂停颗粒在0.5 - 1.0毫升无菌水。
5. 要量化李斯特菌细胞相关金额的总数，打开每个水洗组织由纵向切割用无菌手术刀刀片，然后作出一些横向切割切片组织成更小的碎片。 注：这一步是必不可少的，以确保肠组织不包住周围均质刀片。将肠道片到一个15毫升的离心管中，含有2毫升无菌水。
6. 消毒组织匀浆（费舍尔PowerGen公司1000）探头置于70％的乙醇，省电60％，持续30秒。等待乙醇空气干燥，或过程在无菌水，持续10秒。均质每个TI1分钟SSUE。重复治疗之间的每个样品用无菌水，并用70％的乙醇样品组之间。
7. 准备每个样品的系列稀释液，在无菌水中和BHI / L + G琼脂板。

6。处理感染的肠系膜淋巴结

1. 收获淋巴结无菌条件下，在无菌的冰60毫米盘上的地方，并使用无菌镊子取出所有连接的脂肪。希望找到每鼠3-6节点。
2. 准备丝网屏幕切割不锈钢＃80目1.5-2英寸见方的小块。在每个角落，做一个小切口，向下折叠四边，创造一个凸起的床。浸在95％的乙醇，然后火焰消毒，并在60毫米培养皿中含有0.75毫升无菌水的地方。每次使用后，屏幕可以被回收，在70​​％乙醇中浸泡20分钟，用刷子去除包埋组织擦洗，在2N NaOH中煮沸20〜30分钟，然后与水广泛冲洗。
3. 使用柱塞从无菌3毫升注射器捣烂节点通过筛网。请务必按下屏幕底部的菜，所以它使菜中的水接触。
4. 通过0.75毫升无菌水，通过在屏幕上，然后吸管向上和向下几次冲洗的屏幕。细胞悬液转移到离心管中。
5. 剧烈振荡每份样品，持续30秒，以溶解细胞。准备连续稀释，要么BHI / L + G琼脂板。

7。处理感染脾脏，肝脏，熊胆

1. 抓住脾用无菌镊子和解放两个切口，在每年年底。放置在含有2.5毫升无菌水15毫升管。 （ 注：管圆的底部可能会更容易使用与均质。）
2. 定位胆（一个黄色的小充满液体的囊附着到肝脏）和仔细剪断，用无菌剪刀分离肝无爆裂。 TRANSF呃含1毫升无菌水的离心管中。
3. 无菌操作取出肝脏，一定要删除所有叶，转移到15毫升离心管中含2.5毫升无菌水。
4. 均质所描述的脾脏和肝脏省电60％以上，持续30秒。膀胱Forgall，用无菌剪刀撕开的离心管，然后涡大力，持续30秒。
5. 准备串行稀释和每个要么BHI或BHI / L的样品板+ G琼脂。

8。处理被感染的脑

1. 使用鼠标从背面侧，上述颈部切开皮肤和组织，跨在一个45°角的两个耳朵。使用无菌镊子剥离U形皮瓣皮肤拉向鼻子和暴露的头骨和面部骨骼。
2. 固定颅骨钳与眼睛之间的骨脊，并用剪刀，使浅跨越外侧边缘的头骨。是小心切骨和脑组织。接下来，切骨脊之间的眼睛。使用镊子按住顶部的头骨和向后拉朝脖子露出大脑。
3. 轻轻抬起脑腔含1.5毫升无菌水15毫升离心管中，用无菌镊子和地方。
4. 均质，持续20秒，上述60％的电力。准备连续稀释和BHI或BHI / L + G琼脂板。

9。补充程序：分馏肠组织

9.1细菌分离粘液分数

1. 对于每个肠道组织，准备3管含3毫升6毫米N-乙酰半胱氨酸（NAC;西格玛＃A-9165）。
2. 将通红的和纵向切割组织的第一个试管中1-2分钟，大力纷飞每隔20-30秒。用无菌镊子，拿起纸巾，轻轻挤反对侧管以除去过量的理趣ID。
3. 两次重复步骤9.1.2使用其它NAC管。取出肠道组织，并，预留作进一步处理。
4. 普尔的NAC洗涤（总共9毫升），并在12,000×g离心20分钟。
5. 悬浮颗粒在无菌水，旋涡，持续30秒，准备连续稀释和板BHI / L + G

9.2细菌分离上皮细胞（EC）馏分

1. 每个组织剪切成小块，用无菌剪刀，并将其放置在一个50毫升的管含有5毫升补充有5％FBS（RP-5），5mM的EDTA，和1mM DTT（Invitrogen公司＃21870）的RPMI。振荡培养在37℃，20分钟。
2. 将肠片转移到一个新的管含有5毫升RP5/EDTA/DTT的和振荡培养，在37℃20分钟。从第一管，并预留在37℃储存媒体再次重复这个过程，总三个20分钟在RP5/EDTA/DTT孵化。如果继续固有层ISO特征研一步，转移剩余肠道成空50毫升管件。
3. 将三个RP5/EDTA/DTT的洗涤液（总体积为15毫升），离心沉淀细胞，在低转速（1200 XG）。
4. 为了量化胞菌，收集上清液，并以12000×g离心20分钟。悬浮颗粒在0.5 - 1.0毫升无菌水板连续稀释BHI / L + G琼脂。
5. 枚举细胞内的细菌，悬浮在5毫升含25微克/毫升的庆大霉素RP-5 EC颗粒。单细胞悬液孵育30分钟，在37°C加7％的CO ₂杀任何剩余的外L.菌等 。两次PBS洗细胞，悬浮在0.5ml无菌水，及涡，持续30秒，使细胞裂解。准备系列稀释的水和板BHI / L + G。
   注意：在此阶段收集的细胞也将包含细胞从底层派伊尔氏淋巴集结的修补程序。如果需要的话，可见淋巴集结补丁可以从肠道组织中删除之前，冲洗和纵向切割。

9.3细菌分离固有层（LP）馏分

1. 由向管中加入25ml无菌PBS冲洗过量的二硫苏糖醇（DTT）/ EDTA从肠道件。剧烈摇晃，转移到一个新的管，并重复两次。
2. 将肠道片含有4ml的消化溶液组成的补充有1毫克/毫升的IV型胶原酶和40微克/毫升DNA酶I。孵育在37℃下振摇40分钟RP-5到50毫升管。
3. 未消化件转移到一个新的管含4毫升消化液和重复一次或两次，直到完全消化组织块。每个消化的解决方案，这包含解放唱片细胞的，在37℃下保存
4. 离心汇集消化解决方案，在低转速（1200 XG）沉淀细胞。过程中，上清和细胞所叙述的颗粒分开IBED上面列举的细胞外和细胞内的细菌，分别。

结果

在37°C孵育36-48小时后， 单核细胞增生李斯特菌的菌落BHI / L + G板将是可见的的菌落有一个平滑的，圆顶形的奶白色的外观（ 图1A）。为广大的肠道菌群的生长受到抑制，但它是经常可以看到一些菌落，不L.菌 ，尤其是当镀小肠或结肠的情况下直接显着的稀释（ 图1B）。可疑菌落可以证实电镀在CHROMAGAR ^TM 李斯特板。L.菌出现蓝色菌落白色...

讨论

近交系小鼠喂养一天的时间，统一接受，他们愿意吃了被污染的面包，将取决于应变类型和小鼠¹⁷岁。根据我们的经验，6-9周龄B6小鼠是在一天中的任何时间接受喂食，但BALB小鼠不会坚持吃面包片，除非它是在他们的黑暗周期提供。用于安置动物的房间，可以改变光周期，所以黑暗阶段恰逢实验室工作人员正常工作日。然而，应给予老鼠至少两个星期来适应环境的改变的光周期在感染前。...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Heart Infusion Agar	Difco	BD-241830
Lithium chloride	Sigma	L9650
Glycine	Omnipur	4840
EDTA	Gibco	15575-038
DTT	Sigma	D5545
Collagenase, type IV	Worthington	LS004089
DNAse I	Worthington	LS002007
Diff-Quik	Dade-Behring	B4132-1A
PowerGen 1000 homogenizer	Fisher	14-261-06
stainless steel type 304 mesh #80	Small Parts, Inc.	CX-0080-C
Cytospin	Statspin	M801-22