הילוכים אוראלי של<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בעכברים באמצעות בליעה של מזון מזוהם

Summary

מאמר זה מתאר שיטה חדשה לזיהום אוראלי של עכברים באמצעות חיידקי ליסטריה-מזון מזוהם. הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם חיידקים פתוגנים שמקורן במזון אחר.

Abstract

חיידקי L. הם חיידקים פתוגנים תאיים פקולטטיביים הגורמים לזיהומים בבני אדם שמקורן במזון. מעט מאוד ידוע על שלב העיכול של ליסטריה בשל חוסר מודל חיה קטן המחקה מחלה אנושית באופן הדוק. מאמר זה מתאר מודל עכבר חדשני להעברה אוראלית של ל ' חיידקי. שימוש במודל זה, עכברים שהוזנו ל חיידקי מזוהמים יש לחם שלב דיסקרטי של זיהום במערכת העיכול, ואחריו בדרגות שונות של התפשטות מערכתית בזנים רגישים (BALB / ג / מאת / י) או עמידים (C57BL / 6) עכבר. בשלבים מאוחר יותר של הזיהום, הפצתו לכיס המרה והמוח הוא ציין. מודל שמקורן במזון של ליסטריה הוא לשעתקו מאוד, אינו דורש כישורים מיוחדים, וניתן להשתמש בו במגוון רחב של חיידקים ובודד זני עכבר מעבדה. ככזה, הוא המודל האידיאלי ללמוד שתי האסטרטגיות ארסיות בשימוש על ידי ל ' חיידקי

Introduction

חיידקי ליסטריה הם חיידקים פתוגנים תאיים פקולטטיביים הגורמים לזיהומים בבני אדם שמקורן במזון. החיידקים עמידים בפני רבים של תהליכים המשמשים להגנת אספקת המזון שלנו, כגון ייבוש, המלחה, או ^1,2 קירור וזיהומים מקושרים בדרך כלל ל, מזונות "מוכן לאכילה" מעובדים שאינם מחוממים לפני הצריכה . בכמה התפרצויות קודמות, מקור ל ' מזון מזוהם חיידקי-זוהה, והקבוצה המצומצמת של אנשים שנחשפו הייתה פיקוח הדוק ^3-6. בדוגמאות אלה, מחלה קלינית באנשים בריאים נעה בין קיבה ומעיים קלים, הגבלה עצמית לדלקות מעיים ומערכתיות חמורות יותר שנזקק לאשפוז. L. זיהומי חיידקי באנשים שנפרצו חיסוניים, כולל שני תינוקות והקשישים, היו קשורים עם שיעור תמותה גבוה (25-30%), אפילו עם טיפול אנטיביוטי 7,8. מעט מאוד ידוע על המינון המדבק לL. חיידקי, או את גורמי המארח ששולטים ברגישות לזיהומים לאחר שידור אוראלי, בעיקר בשל חוסר מודל חיה קטן שמשחזר מגוון רחב זה של תוצאות זיהום.

המודל הנפוץ ביותר של דלקת ליסטריה הוא חיסון (IV) תוך ורידי של עכברים. המודל הרביעי הוא לשעתקו מאוד, והיה מאוד שימושית לחקר תגובות תא T הן נאיביות וזיכרון במהלך זיהום ^9,10. החסרון של המודל הרביעי הוא שהיא עוקפת את שלב העיכול של זיהום לחלוטין. אחרי שידור שמקורן במזון, רירית המעיים מספקת מחסום שמאט כנראה ומגביל את מספר החיידקים כי הרף יכול להפיץ לרקמות היקפיות. לעומת זאת, ניתן למצוא את כל הבידוד בטחול ובכבד בתוך דקות של IV ממשל, ובולוס הגדול הזה של אורגניזמים עשוי להציף ד חיסון מולדיםefenses ברקמות אלה. משמש זיהום אוראלי של עכברים על ידי gavage פחות נפוץ, כי מנות גדולות (10 -10 ¹¹ CFU ⁹⁾ נדרשות בדרך כלל כדי להשיג קולוניזציה מעיים ^10. כמו כן, חיסון (IG) intragastric עם מחט האכלה אינו יוצר תקופת שחזור של זיהום במערכת העיכול לפני ההתפשטות מערכתית. מעבדות אחדות דיווחו כי ל ' חיידקי מגיעים לטחול וכבד בתוך 4-12 שעות לאחר זיהום (HPI), בעוד שאחרים לא הראו התפשטות מערכתית עד 48 HPI ^11-15. וריאציה מעבדה למעבדה זו עשויה להיות תוצאה של האופי הפולשני של IG חיסון, אשר יכול לגרום לטראומה קלה לרירית של הוושט, ולקדם את פלישת דם ישירה של החיידקים.

לאחרונה פיתחנו מודל עכבר רומן של אוראלי L. חיידקי לזיהום שמחק באופן הדוק כל שלבי מחלה אנושית ^16. הדבקה מתרחשת כאשר העכברים לבלוע חתיכות של המשךaminated מזון, תהליך שהוא לא טראומטי, ואינו דורש כישורים מיוחדים על ידי חוקרי מעבדה. לתקופה של זמן בדיד (36-48 שעות), ל ' חיידקי reproducibly ליישב רק במערכת העיכול, ובכך מאפשרים חקירה של המנגנונים המשמשים ליסטריה פתוגניים translocate פני רירית המעיים ולהפיץ לרקמות היקפיות. חשוב מכך, ניתן להשתמש במודל כדי ללמוד הבדלים בהתנגדות מולדת מארחת לזיהום. במחקר קודם, הראינו שBALB / ג / מאת / עכברי J היו רגישים מאוד ליסטריה שמקורן במזון, עם שכפול מעריכי של ל ' חיידקי המתרחשים במעיים, הטחול, הכבד וכיס מרה ^16. לעומת זאת, עכברי C57BL / 6 היו עמידים לזיהום שמקורן במזון, עם התישבות זמנית בלבד של ל ' חיידקי המתרחשים בכל אחת מרקמות אלה. תכונה נוספת של המודל שמקורן במזון המחקה מחלה אנושית הדוק היא הפצה טבעיתלמוח התרחש בשלבים מאוחר יותר של הזיהום (dpi 5-7).

Protocol

1. הכנת אגר תקשורת סלקטיבית (BHI / L + G) כדי לעכב חיידקי מעיים

1. לשקול את 26 גרם מוח לב עירוי אגר (Difco), 7.5 גר 'LiCl ו5.0 גרם גליצין ומקום בבקבוק 1 ליטר. הוספת 500 מ"ל של מים מזוקקים.
2. חום על stirrer מגנטי עד שחין אגר, תוך בחישה רצופה. קח את הבקבוק את החום, לתת לבועות להתיישב לזמן קצר, ולאחר מכן להחזיר שוב לרתיחה.
3. . חיטוי למשך 30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס מתחת 16-19 psi על מחזור נוזלי שים לב: לעזוב את הבר סערה בבקבוק.
4. לאזן את התקשורת ל -55 מעלות צלזיוס באמבט מים, או שמגניב ב RT. אל תאפשר הפתרון ליקבל קריר יותר מאשר 55 מעלות צלזיוס או גבישים תהווה באגר. את הגבישים לא לעכב L. חיידקי לצמיחה או משפיעה על התכונות סלקטיבית של אמצעי התקשורת. עם זאת, הגבישים יהיו דומים במראהו למושבות קטנות ויעשו את זה קשה לספור CFU חיידקים.
5. לערבב בעדינותאגר 1 דקות באמצעות stirrer מגנטי. למנוע היווצרות של בועות אוויר. יוצקים את אגר בצלחות פטרי (~ 25 מ"ל / צלחת).
   הערה: זה תקשורת אינה תומכת בצמיחה של כל L. זני חיידקי. לדוגמה, ל ' EGDe חיידקי גדל היטב על אגר זה, עם מושבות גלויות בתוך 36-48 שעות, אבל 10403s לא גדל על המדיה הזו.

2. הכנת inoculum

1. חותכים לחם לבן פרוס (קרוגר) לתוך קטן (2-3 מ"מ) קוביות באמצעות להב מספריים סטרילי אורה סטרילי אזמל. אל תשתמש בקרום. לאחסן יצירות בודדות בצינורות microcentrifuge ב -20 ° C עד היום של הזיהום.
2. באמצעות אזמל סטרילי, לחתוך (0.5-1 ס"מ) גושים קטנים של חמאה מלוחה (קרוגר) ולמקם כל אחד בצינור microcentrifuge סטרילי. צינור אחד יכיל מספיק חמאה כדי להכין 50 - 60 חתיכות לחם. חנות ב -20 ° C עד הצורך.
3. לגדול ל חיידקי בBHI מרק רועדים ב 30 &מעלות; C עד התרבות מגיעה OD של ₆₀₀ ~ 0.8-1.0. הכן 500 aliquots μl בצינורות microcentrifuge, דואג למערבולת המדגם בתדירות גבוהה כל כך כל הצינורות מכילים את אותו המספר של חיידקים. חנות ב -80 ° C.
4. לכיילתי את aliquots החיידקים, להפשיר צינור על קרח, ואז מוסיף 500 מ"ל 9.5 μl לBHI מרק. דגירה של מעמד HR 1.5 ב 30 ° C. דילולים סדרתי צלחת על אגר BHI. מצפה כייל של ~ 1-5 x 10 ⁸ CFU / מ"ל. הערה: אם aliquots הומוגניות מוכן, יכול לצפות כל אחד מהצינורות להניב כייל זה בעת שהוכן באופן דומה עם שונות של 2 עד 4 פי.
5. כדי להדביק עכברים, להכין aliquot של ל ' חיידקי כמתואר בשלב 2.4. כ -20 דקות לפני L. תרבות חיידקי מוכנה, להפשיר את חתיכות הלחם בRT. ממסים aliquot של חמאה על 55 מעלות צלזיוס ונפח קטן מראש חם של PBS ב 55 ° C. הכן חתיכות מספיק לחם, כך שיש לפחות אחד לכל עכברלהיות נגוע וחתיכה נוספת אחד לפחות לקביעת כייל של הבידוד בפועל.
6. המבוסס על כייל קבוע מראש של aliquot החיידקים, לחשב את הנפח הכולל של ל ' תרבות חיידקי דרושה כדי להכין inocula למספר הנדרש של חתיכות לחם. גלולת חיידקים על ידי centrifuging ב 14,000 XG במשך 10 דקות לשאוב את כל המרק וBHI resuspend את החיידקים בנפח קטן של PBS מחומם מראש (חתיכת μl / לחם 2).
7. מערבולת החמאה המומסת, להוסיף לחיידקים (באמצעות נפח כולל שווה לפיסת μl / לחם 3) ומערבבים היטב. הערה: אל תנסו להכין יותר מ 10-15 חתיכות לחם בזמן זה או החמאה יהיה לגבש.
8. עבודה במהירות, μl פיפטה 5 של ההשעיה החיידקים על גבי פיסת לחם אחת בצינור microcentrifuge. הפתרון צריך להיספג לחלוטין על ידי חתיכת הלחם.
9. כדי לקבוע את כייל בפועל של הבידוד, להוסיף 1 מיליליטר סטרילי PBS לאחד piec הלחםes. וורטקס במרץ דקות 1. הכן דילולים סידוריים וצלחת גם BHI וBHI / L + G אגר.
10. הליך חלופי לכייל גבוה (> 10 ⁹ CFU) inocula. אם גלולה חיידקים הוא גדול מדי, זה יכול להיות קשה כדי להשעות בנפח כל כך קטן, וכתוצאה מכך החומר הוא צמיג מאוד, כמו דבק, וכמה מהבידוד עשוי להיצמד לדפנות צינור microcentrifuge. במקרה זה, עדיף לחסן את הלחם בצלחת תרבות 60 מ"מ סטרילי, ולהציע לכל המנה (ללא מכסה) לעכבר (ראה להלן). כל הבידוד עודף שלא נספג על ידי הלחם ולאחר מכן ניתן לאכול ישירות על ידי העכבר. באופן כללי, זה לוקח יותר זמן לעכברים לאכול את כל הלחם וללקק את הצלחת נקיות מהפרוטוקול הסטנדרטי המתוארים להלן, ולכן זה רק השיטה המועדפת בעת התמודדות עם inocula כייל גבוה מאוד.

3. זיהום של עכברים

1. לרכוש נשי BALB / ג / מאת / י (0,010,026 מניות #) וC57BL/6/J (מניית# 000,644) מג'קסון המעבדה (בר הרבור, ME) ולהשתמש ב6-9 שבועות של גיל.
2. מהר עכברי היום אחד (24 שעות) לפני ההדבקה על ידי הסרת את האוכל ולהניח את העכברים בהעלה ריצוף חוט (1 אינץ) (3 # רשת; אלנטאון) כדי למנוע coprophagy. להשאיר מספיק מצעים רק בכלוב לספוג שתן, אבל לא מספיק כדי לרומם את הצואה לשפוך. לאפשר גישה החופשית למים.
3. להדביק את העכברים בתחילת מחזור הכהה, עובד במכסת מנוע זרימה למינרית לבוש עם הנורה אדומה. העבר את עכבר אחת לכלוב ריק (ללא מצעים). בעזרת מלקחיים סטריליים, להעביר את חתיכת הלחם המזוהמת לחלק התחתון של הכלוב הריק. בדרך כלל, העכבר יהיה להרים את חתיכת הלחם ולצרוך אותו לחלוטין בתוך 2-10 דקות. אם העכבר לא לאכול את הלחם מייד, להחזיר את הכלוב למדף ולהשאיר את העכבר ללא הפרעה במשך 20-30 דקות. הרוב המכריע של בעלי חיים לאכול את הלחם תוך פרק זמן זה, עם זאת, ניתן להשאיר את העכברים באין מפריע, ללא גישה לotהאוכל שלה או מים לתקופה של עד 2 שעות.
4. לאחר הדבקה, להחזיר את העכבר לכלוב המקורי שלו ולחדש את צ'או העכבר. תמשיך לבית העכברים בריצוף החוט העלה לתקופת הניסוי.

4. ניטור הרמה של חיידקי Shed בצואה

1. צינורות תווית וmicrocentrifuge מראש שוקל לשמש לאיסוף צואה.
2. עובד במהירות לאחר אחזור לכלוב של עכברים, למקם את כל עכבר בכוס פלסטיק 500 מ"ל. בדרך כלל העכברים יגרשו 1-4 כדורי צואה בתוך 5 דקות.
3. השתמש במלקחיים סטריליים להעברת צואה לצינורות שכותרתו כראוי.
4. לשקול כל צינור ולחשב את המשקל של הצואה על ידי הפחתת המשקל של הצינור הריק. משקלים אופייניים לכדורי צואה נעים 10-30 מ"ג.
5. הוסף PBS על צינור אחד (200 מ"ג μl/30 צואה) ולהשתמש בקיסם סטרילי לכתוש את כדורי הצואה.
6. מערבולת צינור אחד למשך 30 שניות, ואז להכין דילולים ולוחית מספר סידוריים על BHI / L+ G אגר. לספור את מספר המושבות ולחשב צואת CFU / מ"ג.

5. עיבוד של רקמות מעיים נגועות

1. להרדים את העכברים, סביבה נקיה מחיידקים לקצור קיבה ומעיים מכל עכבר כרקמה אחת ולאסוף במנות ריקות 100 מ"מ פטרי.
2. הפרד את המעי דק, מעי גס, וcecum ומניח בצלחות נפרדות 60 מ"מ המאוחסנות על קרח. המעי הדק ניתן לחלק עוד יותר על ידי אורך לשלושה חלקים שווים דומים תריסריון, מעי ריק והמעי עקום כדי להקל על ההסרה של תוכן luminal. לאחר מכן ניתן לעבד את שליש הרקמות או יחד (לCFU למעי דק שלם) או בנפרד. רקמות רטובות ~ 0.5 מ"ל סטרילי PBS לשמור גמישות ולמנוע דמעות במהלך טיפול.
3. ממלאי מזרק מ"ל 10 עם 8 מ"ל סטרילי PBS ולצרף מחט גרם 25. שימוש במלקחיים סטריליים כדי לסחוט את התוכן לתוך כוס luminal פסולת (או צינור 50 מ"ל סטרילי אם אוסף את חיידקי luminal). שפעותשעות 4 מ"ל PBS דרך קצה אחד של הרקמה, השתמש במלקחיים כדי לסחוט את התוכן, ולאחר מכן להפוך את הרקמה שוב ולחזור בצד השני.
4. כדי לכמת את מספר ליסטריה בתכני luminal, צנטריפוגה חום אספו עבור 20 דקות ב XG 12,000, להשעות גלולה ב 0.5 - 1.0 מיליליטר מים סטריליים.
5. כדי לכמת את המספר הכולל של כמות תאים הקשורים ליסטריה, לפתוח כל רקמות נשטפו על ידי חיתוך longitudinally עם להב אזמל סטרילי, ולאחר מכן לבצע כמה חתכים לרוחב לחתוך את הרקמה לרסיסים קטנים. הערה: צעד זה הוא חיוני כדי להבטיח כי רקמת המעי לא לעטוף את להב homogenizer. מעבירים את חתיכות מעיים לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל מים סטריליים 2 מ"ל.
6. לעקר homogenizer רקמות (פישר PowerGen 1000) על ידי הצבת החללית באתנול 70% -60% בכוח למשך 30 שניות. חכה לאתנול לאוויר יבש, או תהליך במים סטריליים עבור 10 שניות. Homogenize כל tissue דקות 1. חזור על טיפול עם מים סטריליים בין מדגם זה, ולהשתמש באתנול 70% בין קבוצות לדוגמה.
7. הכן דילולים סדרתי של כל דגימה במים וצלחת על BHI / L + G אגר סטרילי.

6. עיבוד של בלוטות לימפה נגועות mesenteric

1. בלוטות לימפה קציר הסביבה נקיה מחיידקים, מניחים בצלחת 60 מ"מ סטרילי על קרח, ולהשתמש במלקחיים סטריליים כדי להסיר כל השומן המצורף. לצפות למצוא 3-6 צמתים לכל עכבר.
2. הכן את מסכים רשת תיל על ידי חיתוך חתיכות מרובעות 1.5-2 סנטימטר של פלדה אל חלד # 80 מש. לעשות חתך קטן בכל פינה, ומקפל את ארבעת צדדים, יצירת מיטה מורמת. טובלים באתנול 95% ולאחר מכן להבה לעקר, ומניחים בצלחת פטרי המכילה 60 מ"מ 0.75 מיליליטר מים סטריליים. לאחר כל שימוש, ניתן למחזר את המסכים על ידי השריית באתנול 70% במשך 20 דקות, קרצוף עם מברשת כדי להסיר רקמות משובצות, רותח במשך 20-30 דקות ב2N NaOH, ולאחר מכן שטיפה במים בהרחבה.
3. השתמש את הבוכנהממזרק מ"ל 3 סטרילי לכתוש את בלוטות באמצעות מסך רשת. הקפד לדחוף למטה על המסך לתחתית הצלחת כך שהוא יוצר מגע עם המים בצלחת.
4. לעבור 0.75 מיליליטר מים סטריליים דרך המסך ולאחר מכן פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשטוף את המסך. להעביר את ההשעיה תא צינור microcentrifuge.
5. ורטקס כל מדגם נמרץ למשך 30 שניות לlyse התאים. הכן דילולים ולוחית מספר סידוריים משני BHI / L + G אגר.

7. עיבוד של spleens נגוע, כבדים, וכיס מרה

1. אחוז טחול עם מלקחיים סטרילית ולשחרר על ידי ביצוע שני חתכים, אחד בכל קצה. מקום בצינור המכיל 15 מיליליטר מים סטריליים 2.5 מ"ל. (הערה: צינורות עם תחתית עגולה עשויים להיות קלים יותר לשימוש עם homogenizer.)
2. אתר את כיס המרה (צק נוזלים צהוב קטן המחובר אל הכבד) ולגזור בזהירות עם מספריים סטריליים לניתוק מכבד ללא להתפקע. Transfאה לצינור microcentrifuge המכיל מים סטריליים 1 מ"ל.
3. הסביבה נקיה מחיידקים להסיר את הכבד, והקפד להסיר את כל האונות, ולהעביר צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 2.5 מ"ל של מים סטריליים.
4. Homogenize טחולים וכבדים כמתואר לעיל למשך 30 שניות על 60% כוח. שלפוחיות Forgall, להשתמש במספריים סטריליים לקרוע לגזרים בצינור microcentrifuge, ולאחר מכן מערבולת במרץ למשך 30 שניות.
5. הכן דילולים וצלחת כל דגימה משני BHI או BHI / L + G אגר סדרתיים.

8. עיבוד של מוח נגוע

1. עבודה מהצד האחורי של העכבר, לחתוך את העור ורקמה שמעל לצוואר, ועל פני שתי האוזניים בזווית של 45 מעלות. השתמש במלקחיים סטריליים כדי לקלף את הדש בצורת U של עור על ידי משיכת לכיוון האף ולחשוף את הגולגולת ועצמות פנים.
2. לשתק את הגולגולת על ידי החזקת הרכס הגרמי בין העיניים עם מלקחיים, ולהשתמש במספריים כדי לבצע חתכים רדודים ברחבי הקצוות לרוחב של הגולגולת. להיותזהיר לחתוך רק את העצם ולא רקמת המוח. בשלב הבא, לחתוך את הרכס הגרמי בין העיניים. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את החלק העליון של הגולגולת ומושך לאחור (לכיוון הצוואר) כדי לחשוף את המוח.
3. רם בעדינות את המוח מהחלל שלה באמצעות מלקחיים ומקום סטריליים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 1.5 מיליליטר מים סטריליים.
4. Homogenize במשך 20 שניות בכוח 60% כפי שתואר לעיל. הכן דילולים ולוחית מספר סידוריים משני BHI או BHI / L + G אגר.

9. נוהל משלים: חלוקה של רקמות מעיים

9.1 בידוד של חיידקים בחלק ריר

1. לכל רקמת מעי, להכין 3 צינורות המכילים 3 מ"ל של N-acetylcysteine ​​6 מ"מ (NAC; סיגמא #-9165).
2. הנח את סמוק וlongitudinally לחתוך רקמות בצינור הראשון עבור 1-2 דקות, כל 20-30 במרץ מתערבל שניות. בעזרת מלקחיים סטריליים, להרים את הרקמות ובעדינות ללחוץ על הצד של הצינור כדי להסיר עודפי סבון נוזלייםid.
3. חזרו על פעולה פעמיים נוספת 9.1.2 באמצעות צינורות NAC הנותרים. הסר את רקמת המעי ומניח בצד לעיבוד נוסף.
4. בריכת שוטף NAC (כולל של 9 מ"ל), ו צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 12,000 x גרם.
5. Resuspend את הכדור במים סטריליים, מערבולת למשך 30 שניות, להכין דילולים ולוחית מספר סידוריים על BHI / L + G.

9.2 בידוד של חיידקים בתא חלק אפיתל (EC)

1. לחתוך כל רקמה לחתיכות קטנות עם מספריים סטריליים ומניח בשפופרת 50 מ"ל המכילה 5 מ"ל של RPMI (Invitrogen # 21870) בתוספת 5% FBS (RP-5), 5 מ"מ EDTA, וDTT 1 מ"מ. דגירה לוחץ על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
2. מעבירים את חתיכות מעיים לצינור טרי המכיל RP5/EDTA/DTT 5 מ"ל ו דגירה רועדת על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שמור את התקשורת מהצינור הראשון ומניח בצד על 37 ° C. חזור על תהליך זה פעם נוספת עבור סכום כולל של שלושה 20 דקות בincubations RP5/EDTA/DTT. אם תמשיך לlamina propria ISOצעד רח, להעביר את חלקי המעיים שנותרו לתוך צינור 50 מ"ל ריק.
3. שלב שלושה שוטף RP5/EDTA/DTT (נפח כולל של 15 מ"ל) ו צנטריפוגות במהירות נמוכה (1,200 XG) לגלולת התאים.
4. כדי לכמת חיידקים תאיים, לאסוף את supernatant ו צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 12,000 x גרם. Resuspend גלולה ב0.5 - 1.0 מ"ל מים סטריליים ודילולי סדרתי צלחת על BHI / L + G אגר.
5. למנות חיידקים תאיים, resuspend גלולה EC ב 5 מ"ל של RP-5 המכילים 25 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. דגירה ההשעיה התא בודדת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ועוד 7% CO ₂ להרוג כל שנותר ל 'תאי חיידקי. לשטוף את התאים פעמים PBS, להשעות במי 0.5 מ"ל סטרילי, ומערבולת למשך 30 שניות לlyse התאים. הכן דילולים סידוריים במים וצלחת על BHI / L + G.
   הערה: התאים שנאספו בשלב זה גם יכילו תאים מהתיקונים של Peyer הבסיסי. אם תרצה, Peyer הגלוי שלניתן להסיר כתמים מרקמות המעיים לפני השטיפה וחיתוך longitudinally.

9.3 בידוד של חיידקים בחלק Lamina propria (LP)

1. יש לשטוף DTT / EDTA העודפים מחלקי המעיים על ידי הוספת 25 מ"ל סטרילי PBS לצינור. לנער במרץ, להעביר לתוך צינור טרי וחזור פעמיים.
2. מעבירים את חתיכות מעיים לשפופרת 50 מ"ל המכילה 4 מ"ל של תמיסת עיכול המורכבת של RP-5 בתוספת סוג 1 מ"ג / מיליליטר IV collagenase ו40 מיקרוגרם / מיליליטר DNAse אני רועד דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
3. מעבירים את החתיכות לא מעוכלות לתוך צינור טרי המכיל 4 פתרון עיכול מ"ל ולחזור פעם או פעמיים עד שחתיכות הרקמה מתעכלות לגמרי. שמור כל אחד מפתרונות העיכול, המכילים תאי LP משוחררים, ב 37 ° C.
4. צנטריפוגה את פתרונות העיכול אספו במהירות נמוכה (1,200 XG) לגלולת התאים. לעבד את supernatant ותא גלולה בנפרד כdescribed לעיל כדי למנות חיידקים תאיים ו תאיים, בהתאמה.

תוצאות

מושבות חיידקי L. תהיה גלויות על BHI / L + G צלחות לאחר הדגירה 36-48 שעות ב 37 ° C. יש מושבות מראה חלק, בצורת כיפה שמנת לבנה (איור 1 א). צמיחה תהיה עכבות עבור רוב חיידקי המעיים, אבל זה נפוץ לראות כמה מושבות שאינן L. חיידקי, במיוחד כאשר ציפוי מעי דק או מעי גס ישירות ל?...

Discussion

עכברים טהורים אינם אחיד פתוחים להאכלה בכל שעות היום, והנכונות שלהם לאכול את הלחם המזוהם יהיו תלויים גם בסוג והזן של עכברי גיל ^17. מניסיוננו, 6-9 B6 עכברים ישנים בשבוע הם פתוחים להאכלה בכל שעה ביום, אבל עכברי BALB לא לאכול חתיכת הלחם באופן עקבי אלא אם כן הוא הציע במהלך ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Heart Infusion Agar	Difco	BD-241830
Lithium chloride	Sigma	L9650
Glycine	Omnipur	4840
EDTA	Gibco	15575-038
DTT	Sigma	D5545
Collagenase, type IV	Worthington	LS004089
DNAse I	Worthington	LS002007
Diff-Quik	Dade-Behring	B4132-1A
PowerGen 1000 homogenizer	Fisher	14-261-06
stainless steel type 304 mesh #80	Small Parts, Inc.	CX-0080-C
Cytospin	Statspin	M801-22