の口頭伝達<em&gt;リステリア菌</em&gt;汚染された食品の摂取を介したマウスにおける

要約

本稿で使用して、マウスの経口感染のための新規な方法を説明しますリステリア菌汚染された食品。プロトコルは容易に他の食品媒介性病原細菌での使用に適合させることができる。

要約

リステリア菌は、ヒトにおける食品媒介感染症を引き起こす通性細胞内細菌の病原体である。ほとんど密接に人間の病気を模倣小さな動物モデルの不足によるリステリア症の胃腸の段階についてはほとんど知られていない。本論文では、Lの口頭伝達のための新規なマウスモデルを説明リステリア 。マウス飼育L.は 、このモデルを使用リステリア汚染されたパンは、感受性（BALB / C / J / BY）または耐性（C57BL / 6）マウス系統で全身の広がりの程度を変化させることによって、続いて胃腸感染の離散位相を、持っている。感染の後期段階の間に、胆嚢および脳への普及が観察される。リステリア症の食品媒介性モデルは、非常に再現性がある特殊な技術を必要とせず、細菌の単離および実験マウス系統の多種多様な使用することができる。このように、L.によって使用される病原性戦略の両方を研究するための理想的なモデルであるリステリア

概要

リステリア菌は、ヒトにおける食品媒介感染症を引き起こす通性細胞内細菌の病原体である。細菌が私たちの食糧供給を保護するために使用されるプロセスの多くに耐性があり、乾燥、塩漬け、または冷凍^1,2及び感染症などは、一般的に処理するためにリンクされている、消費前に加熱されていない食品を"すぐに食べる" 。いくつか前の流行、L.のソースでリステリア ·汚染された食品が確認された、露出した個人の制限されたグループは密接に^3-6をモニターした。これらの例では、そうでない健常者における臨床疾患が軽度、自己制限胃腸炎からより重度の腸と全身感染する必要が入院。L.まで変化新生児や高齢者の両方を含む免疫妥協個人、、におけるリステリア感染症であっても抗生物質治療で、高い死亡率（25〜30％）と関連しているまで。リトルはL.のため感染量についてはほとんど知られていないリステリア 、または反復するその小さな動物モデルの不足が主な原因口頭伝達した後、感染症への感受性を支配する宿主因子、感染成果のこの幅広い。

リステリア症の最も広く使用されるモデルは、マウスの静脈内（iv）の接種である。 IVモデルは高い再現性で、感染^9,10時に両方ナイーブおよびメモリーT細胞応答を研究するために非常に有用であった。静脈モデルの欠点は、それが完全に感染の腸相をバイパスすることである。食品媒介送信後、腸粘膜はおそらく遅くなり、継続的に末梢組織に広めることができる細菌の数を制限する障壁を提供する。これとは対照的に、全体の接種は静脈内投与から数分以内に脾臓と肝臓で見つけることができ、かつ生物のこの大ボーラスは自然免疫Dを圧倒することがこれらの組織におけるefenses。大用量（10 ^{9〜10 11} CFU）は、典型的には¹⁰腸管定着^を達成するために必要とされるため、強制経口投与によるマウスの経口感染はあまり一般的に使用される。また、給餌針で胃内（IG）接種は、全身普及に先立って胃腸感染の再現期間を生成しません。いくつかのラボでは、L.ことを報告している他の人が48 HPI ^11-15までは全身の広がりを示さなかったリステリアは 、4-12時間感染後（HPI）以内に脾臓や肝臓に達する。このラボツーラボ変動は食道の粘膜に軽度の外傷をもたらすことができた、IG接種の侵襲性の結果である、と細菌の直接血流の侵入を促進する可能性がある。

我々は最近、経口L.の新規マウスモデルを開発しました密接に人間の病気¹⁶のすべての段階を模倣リステリアは、感染症。マウスは続きの部分を摂取する際に感染症が発生します食品、非外傷性のある​​プロセスを、アミノ化および実験室の研究者によって専門的なスキルを必要としません。時間の離散時間（36-48時間）については、L.リステリアは再現こうして腸粘膜を越え転位および末梢組織に広めるためにリステリア病原性によって使用されるメカニズムの調査を可能にする、唯一の消化管にコロニーを形成する。重要なのは、モデルが感染に対する宿主生来の抵抗の相違を調査するために使用することができる。以前の研究では、BALB / C / Jマウス/ BYはLの指数レプリケーションでは、食品媒介性リステリア症の影響を非常に受けやすいことが示された腸、脾臓、肝臓、胆嚢¹⁶で発生したリステリア 。これとは対照的に、C57BL / 6マウスはL.の唯一の一時的な植民地で、食品媒介感染症に耐性であったこれらの組織の各々に発生したリステリア 。密接に人間の病気を模倣食品媒介モデルの追加の特徴は、自然な普及です脳への感染（5-7 DPI）の後期段階中に発生しました。

プロトコル

1。腸内細菌叢を抑制するために選択寒天培地の調製（BHI / L + G）

1. 26グラムブレインハートインフュージョン寒天（Difco社製）、7.5グラムのLiClと5.0グラムのグリシンと1リットルのフラスコで行わ秤量。脱イオン水500mlを加える。
2. マグネチックスターラー上の熱は寒天が沸騰するまで、継続的に攪拌。熱からフラスコを取り、泡が簡単に和解させてから、再度沸騰に持ち帰る。
3. 。液体サイクルで16-19 psiの下に121℃で30分間のためにオートクレーブ注意：フラスコに攪拌棒を残す。
4. ℃の水浴中で55にメディアを平衡または室温で冷ます。ソリューションは°Cまたは結晶が寒天で形成することになる55より涼しい取得することができないようにしてください。結晶はL.を阻害しないリステリアは、成長やメディアの選択的特性に影響を与える。しかし、結晶は小さなコロニーに外観が似ていますし、それが困難な細菌CFUをカウントするようになります。
5. 優しく混ぜるマグネチックスターラーを用いて1分間寒天。気泡の形成を避ける。ペトリ皿（〜25ミリリットル/プレート）に寒天を注ぐ。
   注：このメディアは、すべてLの成長をサポートしていませんリステリア菌株 。例えば、L.リステリアの EGDEは36-48時間以内に目に見えるコロニーと、この寒天でよく育つが、10403s、このメディアに成長しない。

2。接種の調製

1. 小にスライス白パン（クローガー）をカット（2-3 mm）の滅菌ハサミORA無菌手術用メスの刃を使用してキューブ。痂皮を使用しないでください。感染の日まで-20℃でマイクロチューブ内の個々の作品を保管してください。
2. 滅菌メスを使用し、バター（クローガー）の小（0.5-1 cm）の塊をカットし、滅菌マイクロチューブにそれぞれを配置。 60パンの部分 - 各チューブは、50を準備するのに十分なバターが含まれています。 -20℃で保存し、必要になるまで。
3. L.を育てる30＆で振盪BHIブロス中のリステリア度、文化まで、Cは〜0.8〜1.0のOD _600に達した。サンプルは頻繁にそうチューブのすべての細菌の同じ数が含まれている渦に世話をして、マイクロチューブに500μlのアリコートを準備します。 -80℃で保存
4. 細菌のアリコートを滴定するには、9.5ミリリットルBHIブロスに500μlを添加し、その後、チューブを氷上に解凍。 30℃で1.5時間立ってインキュベート℃、 BHI寒天上で平板希釈系列。 。均質アリコートを調製する場合、2〜4倍の分散と同様にして調製したときに、チューブの各々は、この力価を得ることが期待できる。〜1-5×10 ⁸ CFU / mlの力価の注意を期待する。
5. マウスに感染するには、Lのアリコートを準備ステップ2.4で説明したようにリステリア 。 L.前に約20分リステリア文化は室温でのパンの部分を解凍し、準備ができている。 55でバターのアリコートを溶かし℃、55℃でPBSのプレ暖かい少量少なくとも一つあたりのマウスが存在するように十分にパン片を作製感染しており、実際の接種の力価を決定するための少なくとも1つの余分な部分する。
6. 細菌のアリコートを、所定の力価に基づいて、L.の総体積を計算するリステリア培養物は、パン片に必要な数の接種を準備する必要があった。 10分間、14,000×gで遠心分離によってペレット細菌はすべてBHIブロスを吸引し、予め温めておいたPBS（2μL/パン個）少量の細菌を再懸濁します。
7. 渦溶かしバターを、細菌（3μL/パン部分に等しい総量を使用して）追加し、徹底的にミックス注：一度やバター固化うに複数10-15パン片を作製しようとしないでください。
8. 素早く作業、マイクロ遠心チューブ内の単一のパンの部分に細菌懸濁液5μlのピペット。溶液が完全にパンの部分で吸収されるべきである。
9. 接種の実際の力価を決定するために、パンPIECのいずれかに1ミリリットル滅菌PBSを追加ES。 1分間激しくボルテックス。段階希釈し、プレートの両方BHIとBHI / L + G寒天を準備します。
10. 高力価（> 10 ⁹ CFU）接種の代替手順。細菌ペレットが大きすぎる場合、そのような少量の中断が困難になることができ、得られた材料は、ペーストのように、非常に粘稠であり、接種材料の一部がマイクロチューブの側面に付着してもよい。この場合には、滅菌を60mm培養皿にパンを接種すると、（下記参照）は、マウス全体を皿（蓋なし）を提供することをお勧めします。パンに吸収されていない任意の過剰接種は、その後、マウスで直接食べることができる。非常に高力価接種を扱う場合、一般的に、それはパンのすべてを食べて、下記の標準プロトコルよりクリーンな皿をなめるようにマウスでは時間がかかりますので、これは唯一の方法をお勧めします。

3。マウスの感染

1. / J（株＃0010026）で雌のBALB / cの/を購入しC57BL/6/J（株式＃000644）ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から生後6-9週で使用しています。
2. ファーストフードを取り外して、上げ（1インチ）ワイヤー床（＃3メッシュ;アレン）にマウスを配置することによる感染の前にマウスの1日（24時間）食糞防止のため。必要なだけの尿を吸収するためにケージ内の寝具が、小屋の糞を昇格するのに十分ではないままにしておきます。水への無制限のアクセスを許可します。
3. 赤色の電球を装備層流フードで働く、暗サイクルの開始時にマウスに感染。空（無寝具）ケージにシングルマウスを転送します。滅菌ピンセットを使用して、空のケージの底に汚染されたパンの部分を転送します。通常、マウスはパンの部分をピックアップしますと2-10分以内にそれを完全に消費する。マウスはすぐにパンを食べていない場合は、20〜30分間ラックとマウスが邪魔されないままにケージを返す。動物の大半はこの時間内にフレームが、しかし、マウスがOTにアクセスせず、静置することができたパンを食べるようになる最大2時間までのための彼女の食料や水。
4. 感染後、元のケージにマウスを返すとマウス餌を補充。実験期間上げワイヤーの床にマウスを収容するために続けています。

4。糞便中のシェッド細菌のレベルを監視

1. 糞の収集に使用されるラベルと事前計量マイクロチューブ。
2. マウスのケージを取得した後すぐに働いて、500ミリリットルのプラスチックビーカーに各マウスを置きます。通常のマウスは5分以内に1-4糞便ペレットを追放します。
3. 適切にラベルしたチューブに糞便を転送するために滅菌ピンセットを使用してください。
4. 各チューブに秤量し、取チューブの重量を差し引くことにより糞便の重量を計算する。糞の典型的な重量は10から30 mgの範囲。
5. 各チューブ（200μl/30MGの糞）にPBSを加え、マッシュ糞に滅菌爪楊枝を使用しています。
6. 30秒間ボルテックス各管を、その後BHI / L上で段階希釈し、プレートを準備+ G寒天。コロニー数をカウントし、CFU / mgの糞便を計算します。

5。感染した腸管組織の処理

1. マウスを安楽死させる、無菌的に単一の組織と​​して、各マウスから胃や腸を収穫し、空の100mmペトリ皿に集める。
2. 小腸、盲腸、そして氷の上に格納され独立した60ミリメートルの皿にコロンと場所を分ける。小腸はさらに、管腔内容物の除去を容易にするために、十二指腸、空腸、回腸とを近似する3つの等しい部分に長さで割ったものとすることができる。組織分は、その後いずれか一緒に（全体の小腸あたりCFUの場合）、または別々に処理することができます。柔軟を維持し、取り扱い中の涙を防ぐために〜0.5ミリリットル滅菌PBSでウェットティッシュ。
3. 8ミリリットル滅菌PBSで10ミリリットルの注射器を記入し、25グラムの針を取り付ける。廃棄物のビーカー（または滅菌を50mlチューブ内腔の細菌を収集している場合）に管腔の内容物を絞り出すように滅菌ピンセットを使用してください。なflus組織の一方の端を通してH 4 mlのPBSは、中身を絞り出すために鉗子を使用してから、もう一方の端に組織を裏返して繰り返す。
4. 1.0ミリリットル滅菌水を-腔内容におけるリステリアの数を定量化するために、0.5でペレットを中断、12,000×gで20分間、プールされたフラッシュを遠心。
5. リステリア細胞関連量の合計数を定量化するために、より小さな断片に組織をスライスするには、いくつかの横方向のカットを作るその後滅菌メス刃で縦方向に切断することによって、それぞれの洗浄した組織を開き、 注：このステップでは、確実にするために不可欠である腸組織ホモジナイザー刃を包み込むことはありません。 2ミリリットル滅菌水を含んだ15ミリリットルの遠心管に腸の部分を転送します。
6. 30秒間、60％のパワーで70％エタノールにプローブを配置することによって、組織ホモジナイザー（フィッシャーパワージェン1000）滅菌する。 10秒間乾燥した空気、または滅菌水の処理にエタノールを待ちます。各TIを均質1分間ssue。各サンプル間の滅菌水での処理を繰り返し、サンプルグループ間の70％エタノールを使用する。
7. 滅菌水及びBHI / L + G寒天上のプレートに各サンプルの希釈系列を用意します。

6。感染した腸間膜リンパ節の処理

1. 収穫のリンパ節を無菌、氷の上に滅菌60ミリメートル皿に配置し、接続されているすべての脂肪を除去するために滅菌ピンセットを使用しています。マウス当たり3-6ノードを見つけることを期待する。
2. ステンレス＃80メッシュの1.5-2インチの正方形の部分を切断することにより、ワイヤメッシュスクリーンを準備します。各コーナーに小さなカットを行い、上げ床を作成し、四辺を倒します。 95％エタノール、その後滅菌する炎に浸し、および0.75 mlの滅菌水を含む60ミリメートルペトリ皿で​​開催。それぞれの使用後、スクリーンは、20分間、70％エタノールに浸漬埋組織を除去するためにブラシで擦る、2NのNaOHで20〜30分間煮沸し、次いで水で広範囲に洗浄して再利用することができる。
3. プランジ​​ャーを使用してくださいメッシュスクリーンを通して無菌3ミリリットルの注射器からマッシュへのノード。それは皿に水と接触するように、皿の底には、画面を下に押してください。
4. 画面をすすぎを数回上下にピペッティングし、画面を通して0.75ミリリットル滅菌水を渡すと。マイクロチューブに細胞懸濁液を移す。
5. ボルテックス細胞を溶解するために30秒間、激しく各サンプル。どちらBHI / L + G寒天上で段階希釈し、プレートを準備します。

7。感染脾臓、肝臓、および胆嚢の処理

1. 滅菌ピンセットで脾臓をつかみ、2カット、それぞれの端に1つにすることによって解放する。 2.5ミリリットル滅菌水を含んだ15ミリリットルチューブに場所。 （ 注：ラウンドボトムスとチューブホモジナイザーで使用する方が簡単かもしれません。）
2. 胆嚢（肝臓に取り付ける小さな黄色の液体で満たされた嚢）と破裂することなく、肝臓からデタッチする滅菌ハサミで丁寧にスニップを探します。 TRANSF1ミリリットル滅菌水を含むマイクロチューブへえー。
3. 無菌的にすべての葉を削除することを確認し、肝臓を除去し、滅菌水2.5 mlを入れた15ミリリットルの遠心チューブに移す。
4. として、60％の電源を30秒間上記脾臓と肝臓をホモジナイズする。 Forgallの膀胱は、30秒間、激しくボルテックス後、遠心チューブに引き裂くために滅菌ハサミを使用して、。
5. どちらBHIまたはBHI / L + G寒天上で段階希釈し、プレートの各サンプルを準備します。

8。感染した脳の処理

1. マウスの裏側からの作業は、45°の角度で首の上の皮膚と組織を切断し、両耳を越え。鼻の方に引っ張って皮膚のU字型のフラップ剥離に滅菌ピンセットを使用して、頭蓋骨と顔の骨を公開します。
2. ピンセットで目の間に骨の尾根を保持することによって頭蓋骨を固定し、頭蓋骨の側縁部を越え浅い切り傷を作るハサミを使用しています。ある骨のみではなく、脳組織を切断するように注意してください。次に、目の間に骨の尾根を切った。脳を露出させるために（首に向かって）頭蓋骨の上部を保持し、後方に引っ張るために鉗子を使用してください。
3. ゆっくり1.5ミリリットル滅菌水を含んだ15ミリリットルの遠心チューブに滅菌ピンセットと場所を使用して、その空洞から脳を持ち上げます。
4. 上述したように、60％のパワーで20秒間ホモジナイズする。 BHIまたはBHI / L + G寒天のいずれかで段階希釈し、プレートを準備します。

9。補足手順：腸組織の分画

粘液画分中の細菌の単離9.1

1. 各腸組織の場合は、6 mMのN-アセチルシステイン（;シグマ＃-9165 NAC）の3ミリリットルを含む3チューブを準備します。
2. 紅潮を配置し、縦方向に積極的にすべての20〜30秒を渦巻く、1〜2分間の最初のチューブに組織を切断。滅菌ピンセットを使用して、組織をピックアップし、優しく余分な液体石鹸を削除するには、チューブの側面に絞るイド。
3. 残りNACチューブを使用してさらに2回のステップ9.1.2を繰り返します。腸組織を削除し、さらに処理するために脇に置きます。
4. プールNACの洗浄（9ミリリットルの合計）と、12,000×gで20分間遠心する。
5. 滅菌水、30秒間ボルテックスでペレットを再懸濁し、BHI / L + Gで段階希釈し、プレートを準備

上皮細胞（EC）フラクション中の細菌の単離9.2

1. 5％FBS（RP-5）、5mMのEDTA、および1mM DTTを補充したRPMIを5ml（Invitrogen社＃21870）を含む50ミリリットルチューブに滅菌ハサミと場所の小さな断片に各組織をカット。 °C 20分間37℃で振とう培養する。
2. 5ミリリットルのRP5/EDTA/DTTを含む新しいチューブに腸の部分を移し、37℃で振とうし℃で20分間インキュベートする。第1のチューブからメディアを保存して、37℃で取っておく℃にRP5/EDTA/DTT三20分インキュベーションの合計のためもう一度、このプロセスを繰り返します。粘膜固有層のisoに進む場合lation工程は、空の50mlチューブに残った腸の部分を転送する。
3. 3 RP5/EDTA/DTTの洗浄（15ミリリットルの合計体積）、ペレット細胞に低速（1,200×g）でで遠心分離機を兼ね備えています。
4. 細胞外の細菌を定量化するために、12,000×gで20分間遠心上清を収集します。 0.5でペレットを再懸濁し - 1.0ミリリットル滅菌水とプレートBHI / L + G寒天上で連続希釈。
5. 細胞内細菌を列挙するには、25μgの/ミリリットルゲンタマイシンを含むRP-5 5mlのECペレットを再懸濁します。残りの細胞を死滅させるL.°C +7％CO _2、37℃で30分間、単一細胞懸濁液をインキュベートするリステリア 。細胞を溶解するために30秒間0.5ミリリットル滅菌水、そして渦にサスペンド、PBSで細胞を2回洗浄します。 BHI / L + G上の水とプレートに希釈系列を準備
   注：この段階で収集された細胞はまた、基礎となるパイエル板由来の細胞が含まれています。所望であれば、可視パイアーパッチはフラッシュし、縦方向に切断する前に腸の組織から削除することができます。

粘膜固有層（LP）フラクション中の細菌の単離9.3

1. チューブに25ミリリットル滅菌PBSを追加することで、腸の部分から余分なDTT / EDTAをすすぐ。激しく振り、新鮮なチューブに移し、二回繰り返します。
2. 40分間37℃で振とう1 mg / mlのIV型コラゲナーゼおよび40μgの/ mlのDNアーゼIでインキュベートを補ったRP-5から成る消化溶液4mlを含む50ミリリットルチューブに腸の部分を転送します。
3. 4ミリリットル消化溶液を含む新鮮なチューブに未消化の部分を移し、組織片が完全に消化されるまで一度か二度繰り返す。 37で解放されたLPの細胞を含む消化液、それぞれ、℃に保存し
4. ペレットに低速（1,200 XG）で細胞をプールした消化液を遠心分離。 descrを上清と細胞ペレットを別々に処理するそれぞれ、細胞外と細胞内細菌を列挙するために、上記のアイベッド。

結果

リステリア菌のコロニーは、37℃で36から48時間のインキュベーション後BHI / L + Gプレート上で表示されますコロニーは、滑らかな、ドーム状のクリーミーな白色の外観（ 図1A）を持っています。成長は腸の細菌叢の大半を阻害したが、それはL.ないいくつかのコロニーを見ることが一般的であるされます著しい希釈（ 図1B）せずに直接、小腸または大腸?...

ディスカッション

近交系マウスは、一日のすべての回で餌に均一に受容されず、汚染されたパンを食べるために彼らの意欲は、両方の歪みタイプとマウス¹⁷の年齢によって異なります。我々の経験では、6-9週齢のB6マウスは、一日中いつでも餌を受け入れているが、それは彼らの明暗サイクルの間に提供されていない限り、BALBマウスは一貫して、パンの部分を食べることはありません。暗期は検査室の...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Heart Infusion Agar	Difco	BD-241830
Lithium chloride	Sigma	L9650
Glycine	Omnipur	4840
EDTA	Gibco	15575-038
DTT	Sigma	D5545
Collagenase, type IV	Worthington	LS004089
DNAse I	Worthington	LS002007
Diff-Quik	Dade-Behring	B4132-1A
PowerGen 1000 homogenizer	Fisher	14-261-06
stainless steel type 304 mesh #80	Small Parts, Inc.	CX-0080-C
Cytospin	Statspin	M801-22