Устная Передача<em&gt; Листерий</em&gt; У мышей с помощью употреблении зараженной пищи

Резюме

Эта статья описывает новый метод для перорального заражения мышей с использованием Листерий-Загрязненных продуктов питания. Протокол может быть легко адаптирован для использования с другими пищевыми бактериальных патогенов.

Аннотация

Л. моноцитогенес являются факультативными внутриклеточными бактериальными патогенами, которые вызывают пищевых инфекций у людей. Очень мало известно о желудочно-кишечного фаза листериоза из-за отсутствия небольшого модель животного, которое близко имитирует заболевания человека. Эта статья описывает новую модель мыши для устной передачи L. моноцитогенес. С помощью этой модели мышей, получавших L. моноцитогенес загрязненные хлеб есть дискретная фаза желудочно-кишечную инфекцию, а затем различной степенью системного распространения в восприимчивых (BALB / С / К / J) или устойчивостью (C57BL / 6) линий мышей. На поздних стадиях инфекции, распространения в желчном пузыре и мозга наблюдается. Пищевых модель листериоза является высокой воспроизводимостью, не требует специальных навыков и может быть использован с широким спектром бактериальных изолятов и лабораторные штаммы мыши. Как таковая, она является идеальной моделью для изучения как вирулентность стратегий, используемых L. моноцитогенес

Введение

Листерий являются факультативными внутриклеточными бактериальными патогенами, которые вызывают пищевых инфекций у людей. Бактерии устойчивы к многим из процессов, используемых для защиты наших продуктов питания, таких как сушка, соление, или ^1,2 холодильного и инфекции, как правило, связаны с обработана, "готовых к употреблению" продуктов, которые не нагреваются до потребления . В нескольких предыдущих вспышек, источником L. моноцитогенес-загрязненных продуктов питания был определен, и ограниченной группы лиц, подвергшихся воздействию была под пристальным контролем ^3-6. В тех примерах, клинической картины заболевания у практически здоровых лиц варьировались от мягкого, самоограничения гастроэнтерита более тяжелые кишечные и системные инфекции, которые требуют госпитализации. L. моноцитогенес инфекций у лиц с ослабленным иммунитетом, в том числе и новорожденных и пожилых людей, которые были связаны с высокой смертностью (25-30%), даже при лечении антибиотиками 7,8. Мало что известно о инфекционная доза для L. моноцитогенес, или принимающей факторов, которые регулируют восприимчивость к инфекции после перорального передачи, прежде всего из-за отсутствия небольшой животной модели, которая повторяет этот широкий диапазон инфекции результаты.

Наиболее широко используемой моделью листериоза внутривенно (IV) инокуляции мышей. IV модель является высокая воспроизводимость, и была чрезвычайно полезны для изучения как наивные и памяти Т-клеточного ответа при заражении ^9,10. Недостатком модели IV является то, что он полностью обходит кишечной фазы инфекции. После пищевых передачи слизистой кишечника обеспечивает барьер, который предположительно замедляет и ограничивает количество бактерий, которые могут постоянно распространять в периферические ткани. В отличие от всей посевной могут быть найдены в селезенке и печени в течение нескольких минут внутривенного введения, и это большое болюс организмы могут подавлять врожденной иммунной гefenses в этих тканях. Оральные инфекции мышей через желудочный зонд менее широко используется, потому что большие дозы (10 ⁹ -10 ¹¹ КОЕ), как правило, необходимых для достижения колонизации кишечника ^10. Кроме того, внутрижелудочного (Ig) инокуляцию кормления игла не генерирует воспроизводимое период желудочно-кишечной инфекции до системное распространение. Некоторые лаборатории сообщили, что L. моноцитогенес достичь селезенки и печени в течение 4-12 ч после инфекции (HPI), тогда как другие не показали системного распространения до 48 HPI ^11-15. Эта лаборатория-на-Lab изменения могут быть следствием инвазивный характер IG прививки, которые могут привести к незначительной травме слизистой пищевода, а также содействовать прямым вторжением кровоток бактерий.

Недавно мы разработали новую модель мыши оральный L. моноцитогенес инфекция, которая точно имитирует все этапы болезни человека ^16. Заражение происходит, когда мыши глотать частей продолжениеаминировать питания, процесс, который не является травматическим, и не требует специальных навыков лабораторными исследователями. Для дискретного периода времени (36-48 часов), Л. моноцитогенес воспроизводимо только колонизировать желудочно-кишечном тракте, тем самым позволяя исследование механизмов, используемых патогенных листерий к транслокации через слизистой кишечника и распространять в периферические ткани. Важно отметить, что эта модель может быть использована для изучения различий в хост врожденной устойчивостью к инфекции. В предыдущем исследовании мы показали, что BALB / С / К / J мышей были очень восприимчивы к пищевого листериоза, с экспоненциальным репликации L. моноцитогенес, происходящих в кишечнике, селезенке, печени и желчного пузыря ^16. В отличие от мышей C57BL / 6, были устойчивы к пищевой инфекции, только с переходным колонизации L. моноцитогенес возникающих в каждой из этих тканей. Дополнительной особенностью пищевых модель, которая точно имитирует болезнь человека в том, что природные распространениев мозг произошло во время более поздних стадиях инфекции (5-7 точек на дюйм).

протокол

1. Подготовка селективных средах агар (BHI / L + G) ингибировать кишечной микрофлоры

1. Взвесить 26 г мозга сердечный экстракт агар (Difco), 7,5 г LiCl и 5,0 г глицина и место в 1-литровой колбе. Добавить 500 мл деионизированной воды.
2. Тепло на магнитную мешалку, пока агар закипит, помешивая непрерывно. Возьмите колбу с огня, пускать пузыри урегулировать короткое время, а затем довести до кипения назад снова.
3. . Автоклаве в течение 30 мин при 121 ° С в 16-19 фунтов на квадратный дюйм на жидком цикла Примечание: оставить мешалкой в колбе.
4. Равновесие средствах массовой информации до 55 ° С на водяной бане или дать остыть при комнатной температуре. Не допускайте, чтобы решение, чтобы прохладнее, чем 55 ° C или кристаллы образуют в агара. Кристаллы не ингибируют L. моноцитогенес роста или повлиять на селективные свойства средств массовой информации. Тем не менее, кристаллы будут внешне похожи на небольшие колонии и будет трудно рассчитывать бактериальных КОЕ.
5. Аккуратно перемешайтеагар в течение 1 мин с использованием магнитной мешалки. Избегайте образования пузырьков воздуха. Залить агар в чашки Петри (~ 25 мл / пластина).
   Примечание: Эта среда не поддерживает рост всех L. моноцитогенес штаммов. Например, L. моноцитогенес EGDE хорошо растет на этом агар, с колониями видны в 36-48 часов, но 10403s не растут на этой информации.

2. Приготовление инокулята

1. Вырезать нарезанный белый хлеб (Kroger) на мелкие (2-3 мм) в форме кубиков с использованием стерильных ножниц Ora стерильным скальпелем. Не используйте корок. Хранить отдельные части в микроцентрифужных пробирках при температуре от -20 ° C до дня инфекции.
2. Используя стерильный скальпель, нарезать небольшими (0,5-1 см) куски соленого масла (Kroger) и поместите каждое в стерильную пробирку микроцентрифужные. Каждая трубка будет содержать достаточно масла, чтобы подготовить 50 - 60 штук хлеба. Хранить при температуре от -20 ° C до необходимости.
3. Расти L. моноцитогенес в бульоне BHI встряхивании при 30 &град; С, пока культура не достигнет OD ₆₀₀ ~ 0,8-1,0. Подготовьте 500 мкл аликвоты в микроцентрифужных пробирках, заботясь, чтобы вихрь образца часто так все трубы содержат одинаковое количество бактерий. Хранить при температуре -80 ° C.
4. Для титрования бактериальной аликвоты, оттепель пробирку на льду, а затем добавить 500 мкл до 9,5 мл BHI бульона. Выдержите в течение 1,5 часа стоя при 30 ° С. Пластина серийных разведений на агаре BHI. Ожидать титра ~ 1-5 × 10 ⁸ КОЕ / мл. Примечание: Если однородный аликвоты подготовлено, можно ожидать каждую из пробирок с получением титра при этом получают аналогичным способом с дисперсией от 2 до 4 раз.
5. Для заражения мышей, подготовить аликвотой L. моноцитогенес как описано в пункте 2.4. Примерно 20 мин до L. моноцитогенес культуре готов, растопить хлеба частей при комнатной температуре. Расплава аликвоту масло при температуре 55 ° С и предварительно теплой небольшом объеме PBS при 55 ° С. Подготовьте хлеба куски так, что есть по крайней мере один на мышьбыть зараженным и по крайней мере один лишний кусок для определения титра фактической посевной.
6. На основе заданных титр бактериальной аликвоты, рассчитать общий объем L. моноцитогенес культуры, необходимое для подготовки инокулята для необходимого количества хлеба куски. Гранул бактерий путем центрифугирования при 14000 х г в течение 10 мин Аспирируйте все бульона BHI, и ресуспендируют бактерии в небольшом количестве подогретого PBS (2 мкл / кусок хлеба).
7. Vortex растопленное сливочное масло, добавить в бактерий (с использованием общего объема, равного 3 мкл / кусок хлеба) и тщательно перемешать. Примечание: Не пытайтесь подготовить более 10-15 штук хлеба за один раз или масло затвердеть.
8. Рабочие быстро, пипетка 5 мкл бактериальной суспензии на одну часть хлеба в микроцентрифужных трубки. Решение должно быть полностью поглощается кусок хлеба.
9. Для определения фактического титр инокулята, добавляют 1 мл стерильной PBS с одним из хлеба PiecES. Вортексе в течение 1 мин. Подготовьте серийные разведения и пластины как BHI и BHI / L + G агара.
10. Альтернативные процедуры высоком титре (> 10 ⁹ КОЕ) посевного. Если бактериальный осадок является слишком большим, это может быть трудно приостановить в таком небольшом объеме, а полученный материал очень вязкими, как паста, и некоторые из инокулята может прилипнуть к сторонам трубки микроцентрифужных. В этом случае, лучше для инокуляции хлеб в стерильной культуре блюдо 60 мм, и предложить все блюдо (без крышки) к мыши (см. ниже). Любое превышение посевной, которая не поглощается хлеб может быть съедено непосредственно с помощью мыши. В общем, это занимает больше времени для мышей, чтобы съесть все хлеба и лизать блюда очищаете, чем стандартный протокол, описанный ниже, так что это только предпочтительный метод при работе с очень высоким титром посевной.

3. Заражение мышей

1. Купить женский BALB / С / К / J (Лот № 0010026) и C57BL/6/J (со# 000644) из лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME) и использовать в 6-9 недельного возраста.
2. Быстро мыши один день (24 часа) до инфицирования, удалив питание и размещение мышей на поднятый (1 дюйм) провод пол (№ 3 меш; Allentown), чтобы предотвратить копрофагией. Оставьте только достаточно постельных принадлежностей в клетке, чтобы поглотить мочу, но не достаточно, чтобы поднять пролить калом. Предоставить неограниченный доступ к воде.
3. Infect мышей в начале темной цикл, работающий в ламинарном потоке оснащен красного света. Передача одной мыши в пустой (без постельных принадлежностей) клетки. Использование стерильным пинцетом, передавать загрязненных кусок хлеба на дно пустой клетке. Как правило, мышь будет забрать кусок хлеба и потребляют его полностью в течение 2-10 мин. Если мышь не ест хлеба сразу, вернуть клетку, чтобы ломать и оставить мышь в покое на 20-30 мин. Большинство животных будут есть хлеб в течение этого времени, однако, мышей можно не трогать, не имея доступа к аее пищи и воды до 2 часов.
4. После заражения, вернуться мыши в исходное клетке и наполняйте мыши чау. Продолжить для размещения мыши на поднятых провод пол в течение всего срока эксперимента.

4. Мониторинг уровень бактерий в кале Сарай

1. Этикетка и предварительно взвешивать микроцентрифужных пробирках, которые будут использоваться для сбора кала.
2. Рабочие быстро после извлечения клетки мышей, каждая мышь поместить в пластиковый стакан 500 мл. Обычно мышей выгонит 1-4 гранулы стула в течение 5 мин.
3. Использование стерильного пинцета передать кала соответствующей маркировкой труб.
4. Взвесить каждую пробирку и вычислить вес кала путем вычитания веса пустой трубы. Типичный вес для фекальные шарики в диапазоне от 10-30 мг.
5. Добавить PBS в каждую пробирку (200 мг μl/30 кала) и использовать стерильные зубочистку, чтобы пюре фекальные шарики.
6. Вихревые каждую пробирку в течение 30 сек, а затем подготовить серийных разведений и пластину на BHI / л+ G агара. Подсчитайте количество колоний и рассчитать КОЕ / мг калом.

5. Обработка зараженных тканей кишечника

1. Усыпить мышей, асептических урожай желудка и кишечника от каждой мыши как единая ткань и собрать в пустую 100 мм чашки Петри.
2. Отделите тонкого кишечника, слепой кишки и ободочной кишки и место в отдельном 60 мм чашки хранят на льду. Тонком кишечнике может быть далее разделена по длине на три равные части аппроксимирующего двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку, чтобы облегчить удаление просвета содержимого. Ткань трети затем могут быть обработаны либо вместе (в КОЕ на весь тонкий кишечник) или по отдельности. Влажные салфетки с ~ 0,5 мл стерильной PBS держать гибким и предотвратить разрывы во время обработки.
3. Заполните шприц 10 мл с 8 мл стерильной PBS и приложите 25 г иглы. Использование стерильного пинцета выдавить содержимое в просвете отходов стакан (или 50 мл стерильной трубки, если сбор бактерий просвета кишечника). ПФРч 4 мл PBS через один конец ткани, используйте щипцы, чтобы выдавить содержимое, а затем переверните ткань и повторите на другом конце.
4. Для количественной оценки количества Listeria в просвете содержимое, центрифугируют объединенных приливы течение 20 минут при 12000 х г, приостанавливать осадок в 0,5 - 1,0 мл стерильной воды.
5. Для количественной оценки общего числа клеточно-ассоциированных количество Listeria, открыть каждый промытые ткани за счет сокращения продольно стерильным скальпелем, а затем сделать несколько боковыми разрезами разрезать ткань на более мелкие фрагменты. Примечание: этот шаг необходим для того, чтобы ткани кишечника не будет циклически гомогенизатора лезвия. Передача кишечного части в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую 2 мл стерильной воды.
6. Стерилизация тканевом гомогенизаторе (Fisher PowerGen 1000) путем размещения зонда в 70% этаноле при 60% мощности в течение 30 сек. Подождите этанола высохнуть на воздухе, или процесс в стерильной воде в течение 10 сек. Гомогенизируют каждого Tiы п в течение 1 мин. Повторить лечение стерильной водой между каждым образцом, а также использовать 70%-ного этанола между образцом групп.
7. Подготовка серийных разведений каждого образца в стерильной воде и пластину на BHI / л агара + G.

6. Обработка зараженных брыжеечных лимфатических узлов

1. Урожай лимфатических узлов асептических, место в стерильном 60 мм блюдо на льду, а также использование стерильного пинцета, чтобы удалить все прилегающего жира. Ожидать, чтобы найти 3-6 узлов на мышь.
2. Подготовьте экранов сетки за счет сокращения 1,5-2 дюйма квадратные куски из нержавеющей стали # 80 сетки. Сделайте небольшой надрез в каждом углу, и сложить четыре стороны, создавая гребнях. Падение в 95% этанола, а затем пламя для стерилизации, и место в 60 мм чашки Петри содержащие 0,75 мл стерильной воды. После каждого использования, экраны могут быть переработаны путем замачивания в 70% этаноле в течение 20 мин, протереть щеткой, чтобы удалить срезах тканей, кипячение в течение 20-30 мин в 2N NaOH, а затем промывки большим количеством воды.
3. Используйте поршеньиз стерильной 3 мл шприц пюре узлов через сито. Будьте уверены, чтобы надавить на экране, чтобы дно тарелки так что имеет контакт с водой в чашке.
4. Проход 0,75 мл стерильной воды через сито и затем пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы промыть экрана. Передача клеточной суспензии в микроцентрифужных трубки.
5. Вихревые каждого образца энергично в течение 30 секунд, чтобы лизировать клетки. Подготовьте серийные разведения и пластины с обеих BHI / л агара + G.

7. Обработка зараженных селезенки, печени и желчные пузыри

1. Возьмите селезенки стерильным пинцетом и освободить сделав два разреза, по одному на каждом конце. Место в 15 мл пробирку, содержащую 2,5 мл стерильной воды. (Примечание: трубы с круглым днища могут быть проще в использовании гомогенизатора с.)
2. Найдите желчного пузыря (маленький желтый заполненный жидкостью мешок, прикрепленный к печени) и СНиП тщательно стерильными ножницами отделяется от печени без разрывов. Transfэр в микроцентрифужных пробирку, содержащую 1 мл стерильной воды.
3. Асептически удалить печень, удалив все доли, и трансфер в 15 мл центрифужные пробирки, содержащие 2,5 мл стерильной воды.
4. Однородный селезенки и печени, как описано выше в течение 30 сек на 60% мощности. Forgall пузыри, используйте стерильные ножницы, чтобы разорвать в микроцентрифужных трубки, а затем вихрь энергично в течение 30 сек.
5. Подготовьте серийные разведения и пластины каждого образца по обе BHI или BHI / L + G агара.

8. Обработка зараженных Мозги

1. Работа на задней стороне мыши, порезать кожу и ткань выше шеи, и через оба уха на 45 °. Использование стерильного пинцета снять с П-образный лоскут кожи, потянув по направлению к носу и разоблачить черепа и лицевых костей.
2. Зафиксировать черепа, удерживая костного гребня между глазами с пинцетом и ножницами, чтобы сделать мелкий пересекает боковые края черепа. Бытьосторожным, чтобы отрезать только кости, а не ткани мозга. Затем вырезать костный выступ между глазами. Используйте пинцет, чтобы удерживать верхнюю часть черепа и тянуть в обратном направлении (к шее), чтобы разоблачить мозга.
3. Аккуратно поднимите мозга от ее полость помощью стерильного пинцета и поместить в центрифугу 15 мл пробирку, содержащую 1,5 мл стерильной воды.
4. Гомогенизируют в течение 20 сек на 60% мощности, как описано выше. Подготовьте серийные разведения и пластины с обеих BHI или BHI / L + G агара.

9. Справочная Процедура: фракционирование тканей кишечника

9.1 Выделение бактерий в слизи Фракция

1. Для каждой ткани кишечника, готовить 3 пробирки, содержащие 3 мл 6 мм N-ацетилцистеина (NAC, Sigma # A-9165).
2. Поместите покраснел и продольно разрезать ткань в первую трубку в течение 1-2 минут, энергично закрученного каждые 20-30 сек. С помощью стерильного пинцета, подобрать ткань и слегка сжать против стороне трубки, чтобы удалить избыток жидкого мылаID.
3. Повторите шаг 9.1.2 два раза больше, используя оставшиеся трубы NAC. Снимите кишечная ткань и отложите в сторону для дальнейшей обработки.
4. Бассейн NAC моет (всего 9 мл), и центрифуги в течение 20 мин при 12000 х г.
5. Ресуспендируют осадок в стерильной воде вихрь в течение 30 сек, готовят серийные разведения и пластину на BHI / л + G.

9.2 Выделение бактерий в эпителиальной клетки (ЕС) Фракция

1. Cut каждой ткани на мелкие кусочки стерильными ножницами и помещают в 50 мл пробирку, содержащую 5 мл среды RPMI (Invitrogen # 21870) с добавлением 5% FBS (RP-5), 5 мМ ЭДТА и 1 мМ DTT. Инкубируют встряхивании при 37 ° С в течение 20 мин.
2. Передача кишечного частей в свежую пробирку, содержащую 5 мл RP5/EDTA/DTT и инкубировать встряхивании при 37 ° С в течение 20 мин. Сохранить средств массовой информации из первой пробирки и отложите в сторону при 37 ° С. Повторите эту процедуру еще раз в течение в общей сложности три 20 мин инкубации в RP5/EDTA/DTT. Если перейти к собственной пластинки ISOLation шагом, перевести оставшуюся кишечной части в пустом 50 мл трубки.
3. Смешайте три RP5/EDTA/DTT смывки (общий объем 15 мл) и центрифугируют при низкой скорости (1200 мкг) для осаждения клеток.
4. Для количественной оценки внеклеточной бактерии, собирают супернатант и центрифугировали 20 мин при 12000 х г. Ресуспендируют гранул в 0,5 - 1,0 мл стерильной воды и пластиной серийные разведения на BHI / L + G агара.
5. Чтобы перечислить внутриклеточных бактерий, ресуспендируйте EC осадок в 5 мл РП-5, содержащий 25 мкг / мл гентамицина. Инкубируйте клеточной суспензии в течение 30 мин при 37 ° С плюс 7% CO ₂ уничтожить оставшиеся внеклеточный L. моноцитогенес. Промыть клетки дважды в ЗФР, приостанавливать в 0,5 мл стерильной воды, и вихрь в течение 30 сек, чтобы лизировать клетки. Подготовьте серийные разведения в воде и пластину на BHI / L + G.
   Примечание: клетки, собранные на этом этапе будет также содержать клетки от Patches основной пейеровых. При желании, видимый пейеровыхИсправления могут быть удалены из тканей кишечника перед промывкой и резки в продольном направлении.

9.3 Выделение бактерий в собственную пластинку (LP) Фракция

1. Промыть избыток ДТТ / ЭДТА из желудочно-кишечного части добавлением 25 мл стерильного PBS к трубе. Энергично встряхните, перевод на новую пробирку и повторить дважды.
2. Передача кишечного части в 50 мл пробирку, содержащую 4 мл пищеварение раствор, состоящий из RP-5 с добавлением 1 мг / мл коллагеназы типа IV и 40 мкг / мл ДНКазы I. Инкубировать встряхивании при 37 ° С в течение 40 мин.
3. Передача непереваренные кусочки в чистую пробирку, содержащую 4 мл раствора и пищеварения повторить один или два раза, пока кусочки тканей не полностью переваривается. Сохранение каждого пищеварение решений, которые содержат освобожденные клетки LP, при 37 ° С.
4. Центрифуга объединенных решений пищеварение на низкой скорости (1200 мкг) для осаждения клеток. Процесс супернатант и осадок клеток отдельно, как DescrIBED выше перечислить внеклеточных и внутриклеточных бактерий соответственно.

Результаты

Л. моноцитогенес колонии будет виден на BHI / L + G пластин через 36-48 часа инкубации при 37 ° С. Колонии имеют гладкую, куполообразные кремово-белый внешний вид (рис. 1А). Рост будет запрещен для большинства кишечной микрофлоры, но это часто можно увидеть некоторые колонии, которы?...

Обсуждение

Инбредных мышей не равномерно восприимчивы к кормлению в любое время дня, и их готовность едят загрязненные хлеб будет зависеть как от типа деформации и возраста мышах ^17. По нашему опыту, 6-9 недельных мышей В6 восприимчивы к кормлению в любое время дня, но мышам BALB не будет последов...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Heart Infusion Agar	Difco	BD-241830
Lithium chloride	Sigma	L9650
Glycine	Omnipur	4840
EDTA	Gibco	15575-038
DTT	Sigma	D5545
Collagenase, type IV	Worthington	LS004089
DNAse I	Worthington	LS002007
Diff-Quik	Dade-Behring	B4132-1A
PowerGen 1000 homogenizer	Fisher	14-261-06
stainless steel type 304 mesh #80	Small Parts, Inc.	CX-0080-C
Cytospin	Statspin	M801-22