Transmissão Oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em camundongos através de ingestão de alimentos contaminados

Resumo

Este artigo descreve um novo método para a infecção oral de camundongos, usando Listeria monocytogenes contaminados. O protocolo pode ser facilmente adaptado para utilização com outros agentes patogénicos bacterianos transmitidas pela comida.

Resumo

L. monocytogenes são facultativos patógenos intracelulares que causam infecções de origem alimentar em humanos. Muito pouco se sabe sobre a fase de listeriose gastrointestinal, devido à falta de um modelo animal de pequeno porte que imita a doença humana. Este artigo descreve um novo modelo do rato para a transmissão oral de L. monocytogenes. Usando esse modelo, ratos alimentados com L. Listeria contaminado pão tem uma fase discreta de infecção gastrointestinal, seguido por diversos graus de disseminação sistémica em estirpes de ratinho susceptíveis (BALB / c / por / J) ou resistentes (C57BL / 6). Durante as últimas fases da infecção, a divulgação da vesícula biliar e do cérebro é observada. O modelo de listeriose de origem alimentar é altamente reprodutível, não requer conhecimentos especializados, e pode ser usado com uma grande variedade de isolados de bactérias e estirpes de ratinho de laboratório. Como tal, é o modelo ideal para estudar a virulência ambas as estratégias utilizadas por L. monocytogenes

Introdução

Listeria monocytogenes são facultativos patógenos intracelulares que causam infecções de origem alimentar em humanos. As bactérias são resistentes a muitos dos processos utilizados para proteger a fonte de alimento, tais como a secagem, a salga, ou ^1,2 refrigeração e infecções são normalmente ligados a transformados, "pronto-a-comer" alimentos que não são aquecidos antes de serem consumidos . Em vários surtos anteriores, a fonte de L. Listeria alimentos contaminados foi identificado, e o grupo restrito de indivíduos expostos foi cuidadosamente monitorizados ^3-6. Nesses exemplos, a doença clínica em indivíduos saudáveis ​​variou de um leve, auto-limitante gastroenterite a infecções intestinais e sistêmicas mais graves que necessitaram de internação hospitalar. L. infecções monocytogenes em indivíduos imunes comprometidos, incluindo os recém-nascidos e pessoas idosas, têm sido associadas com uma elevada taxa de mortalidade (25-30%), mesmo com o tratamento antibiótico 7,8. Pouco se sabe sobre a dose infecciosa para L. monocytogenes, ou os fatores do hospedeiro que determinam a susceptibilidade à infecção após a transmissão oral, principalmente devido à falta de um modelo animal de pequeno porte que recapitula esta vasta gama de resultados de infecção.

O modelo mais largamente utilizado é de listeriose a inoculação intravenosa (iv) de ratinhos. O modelo IV é altamente reprodutível, e tem sido extremamente útil para estudar as respostas de células T tanto naive e de memória durante a infecção ^9,10. A desvantagem do modelo IV é que contorna completamente a fase de infecção intestinal. Depois de comida transmissão transmitidas, na mucosa intestinal proporciona uma barreira que, presumivelmente, retarda e limita o número de bactérias que podem disseminar continuamente para os tecidos periféricos. Em contraste, a totalidade do inoculo podem ser encontrados no baço e no fígado dentro de minutos após a administração iv, e este grande bolus de organismos podem sobrecarregar d imune inataefenses nestes tecidos. A infecção oral de ratos por gavagem é menos usada, uma vez que grandes doses (10 ⁹ -10 ¹¹ CFU) são normalmente necessários para alcançar colonização intestinal ^10. Além disso, a inoculação intragástrica (IG) com uma agulha de alimentação não gera um período reprodutível de infecção gastrointestinal antes da disseminação sistémica. Alguns laboratórios relataram que L. monocytogenes atingir o baço e fígado dentro de 4-12 horas após a infecção (hpi), enquanto outros não mostraram disseminação sistêmica até 48 hpi ^11-15. Esta variação de laboratório para laboratório pode ser uma consequência da natureza invasiva da ig inoculação, o que pode resultar em menor trauma para o revestimento do esófago, e promover a circulação sanguínea invasão directa das bactérias.

Recentemente, desenvolveu um novo modelo de mouse oral, L. infecção por Listeria que imita de perto todas as fases da doença humana ^16. A infecção ocorre quando os ratinhos ingerir pedaços de contaminados comida, um processo que não é traumático, e não requer habilidades especializadas por investigadores do laboratório. Durante um período limitado de tempo (36-48 horas), L. Listeria reprodutivelmente apenas colonizar o trato gastrointestinal, permitindo assim a investigação dos mecanismos utilizados pelo patogénico Listeria para translocar através da mucosa intestinal e disseminar para tecidos periféricos. É importante ressaltar que o modelo pode ser usado para estudar as diferenças na resistência inata do hospedeiro à infecção. Em um estudo anterior, mostramos que BALB / c / por / J camundongos foram altamente suscetíveis à listeriose transmitida por alimentos, com a replicação exponencial de L. Listeria que ocorrem no intestino, o baço, o fígado, vesícula biliar e ^16. Em contraste, os ratinhos C57BL / 6 foram resistentes à infecção transmitida por alimentos, com apenas a colonização de L. transiente Listeria ocorrendo em cada um destes tecidos. Uma característica adicional do modelo de origem alimentar que imita a doença humana é que a disseminação naturaispara o cérebro ocorreu durante as fases posteriores da infecção (dpi 5-7).

Protocolo

1. Preparação de meios de agar selectivas (BHI / L + L) para inibir a microbiota intestinal

1. Pesar 26 g Cérebro Heart Infusion Agar (Difco), 7,5 g LiCl e 5,0 g de glicina e coloque em um frasco de 1 litro. Adicionar 500 ml de água desionizada.
2. Aquecer em um agitador magnético até que as bolhas de agar, agitando continuamente. Pegue o frasco fora do fogo, deixe que as bolhas resolver brevemente e, em seguida, trazer de volta a ferver novamente.
3. . Autoclave durante 30 minutos a 121 ° C sob 16-19 psi num ciclo de líquidos Nota: deixar a barra de agitação no frasco.
4. Equilibrar a mídia para 55 ° C num banho de água ou de deixar arrefecer à temperatura ambiente. Não permitir que a solução para se mais frio do que 55 ° C ou irá formar cristais no agar. Os cristais não inibem L. crescimento monocytogenes ou afetar as propriedades seletivas da mídia. No entanto, os cristais será semelhante em aparência a pequenas colônias e vai dificultar a contagem de UFC de bactérias.
5. Misture delicadamente oagar, durante 1 minuto, utilizando um agitador magnético. Evitar a formação de bolhas de ar. Deite o ágar em placas de Petri (~ 25 ml / placa).
   Nota: Esta mídia não suporta o crescimento de todos L. cepas monocytogenes. Por exemplo, L. monocytogenes EGDE cresce bem neste agar, com colónias visíveis dentro de 36-48 horas, mas 10403s não cresce nessa mídia.

2. Preparação do inoculo

1. Corte o pão branco fatiado (Kroger) em pequenas (2-3 mm) cubos com uma tesoura estéril, ora lâmina de bisturi estéril. Não use as crostas. Armazenar peças individuais em tubos de microcentrífuga a -20 ° C até ao dia da infecção.
2. Usando um bisturi estéril, cortar pequenos (0,5-1 cm), pedaços de manteiga com sal (Kroger) e coloque cada um em um tubo de microcentrífuga estéril. Cada tubo irá conter manteiga suficiente para preparar 50 - 60 partes do pão. Armazenar a -20 ° C até ser necessário.
3. Crescer L. monocytogenes em caldo BHI sacudindo a 30 edeg; C até a cultura atingir uma _DO600 de ~ 0,8-1,0. Preparar 500 mL alíquotas em tubos de microcentrífuga, tendo o cuidado de vórtice da amostra com frequência para todos os tubos contêm o mesmo número de bactérias. Armazenar a -80 ° C.
4. Titule a aliquotas bacterianas, descongelar um tubo em gelo e, em seguida adicionar 500 ul de 9,5 ml de caldo BHI. Incubar por 1,5 horas, ficar a 30 ° C. Placa de diluições em série em agar BHI. Esperar um tulo de ~ 1-5 x 10 ⁸ UFC / ml Nota:. Se aliquotas homogéneos são preparados, pode esperar que cada um dos tubos para se obter este título, quando preparado de um modo semelhante com uma variação de 2 a 4 vezes.
5. Para infectar camundongos, prepare uma alíquota de L. Listeria, conforme descrito no passo 2.4. Cerca de 20 min antes do L. cultura monocytogenes está pronto, descongelar os pedaços de pão na RT. Derrete-se uma alíquota de manteiga a 55 ° C e pré-aquecer um pequeno volume de PBS a 55 ° C. Prepare pedaços de pão suficiente para que haja pelo menos um por ratinhoa ser infectados e pelo menos uma peça adicional para a determinação do título do inoculo real.
6. Com base no título predeterminado da alíquota bacteriana, calcular o volume total de L. Listeria cultura necessário para preparar o inoculo para o número necessário de partes do pão. Agregar as bactérias por centrifugação a 14.000 xg durante 10 min Aspirar todo o caldo BHI e voltar a suspender as bactérias em um pequeno volume de PBS pré-aquecido (2 ul / pedaço de pão).
7. Vortex a manteiga derretida, adicione a bactérias (usando um volume total igual a 3 mL / pedaço de pão) e misture bem Nota:. Não tente preparar mais de 10-15 pedaços de pão ao mesmo tempo ou a manteiga solidificar.
8. Trabalhando de forma rápida, uma pipeta de 5 mL da suspensão bacteriana sobre um único pedaço de pão num tubo de microcentrífuga. A solução deve ser completamente absorvida pelo pedaço de pão.
9. Para determinar o título real do inoculo, adicionar 1 ml de PBS estéril a uma das piec pãoes. Vortex vigorosamente durante 1 min. Preparar diluições em série e placa tanto BHI e BHI / L + G agar.
10. Procedimento alternativo para o título elevado (> 10 ⁹ CFU) inóculos. Se o sedimento bacteriano é muito grande, pode ser difícil de suspender num volume tão pequeno, e o material resultante é muito viscosa, como uma pasta, e algum do inoculo podem colar-se os lados do tubo de microcentrífuga. Neste caso, é melhor para inocular o pão num prato esterilizado de 60 mm de cultura, e para oferecer toda a cápsula (sem tampa) do rato (ver em baixo). Qualquer excesso de inoculo que não é absorvida pelo pão pode então ser comido directamente pelo rato. Em geral, leva mais tempo para que os ratos comem todos do pão e lamber o prato limpo do que o protocolo padrão descrito abaixo, de modo que este é apenas o método preferido quando se trata de muito alta inóculos título.

3. Infecção de Ratos

1. Compra fêmea BALB / c / por / J (stock # 0010026) e C57BL/6/J (estoque# 000644) do Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME) e usar em 6-9 semanas de idade.
2. Rápida dos ratos de um dia (24 horas) antes da infecção por remoção de alimentos e colocando-as em ratinhos (1 polegada) de revestimento de arame levantada (malha # 3; Allentown) para evitar a coprofagia. Deixe apenas roupa de cama suficiente na gaiola para absorver a urina, mas não o suficiente para elevar as fezes derramado. Permitir acesso irrestrito à água.
3. Infect os ratos no início do ciclo de escuro, a trabalhar numa câmara de fluxo laminar, equipado com uma lâmpada vermelha. Transferir um único rato a um (sem cama) gaiola vazia. Utilizando um fórceps estéril, transferir o pedaço de pão contaminado para o fundo da gaiola vazio. Normalmente, o rato vai pegar o pedaço de pão e consumi-lo inteiramente dentro de 2-10 min. Se o rato não come o pão de imediato, retornar a gaiola para quebrar e deixar o mouse em repouso por 20-30 min. A maioria dos animais vão comer o pão dentro deste prazo, no entanto, os ratos pode ser deixada intacta, sem acesso a otsua comida ou água por até 2 horas.
4. Após a infecção, o retorno do mouse para sua gaiola original e repor o mouse comida. Continuar a alojar os ratinhos num pavimento de fio levantado para a duração da experiência.

4. Monitorar o nível de bactérias eliminadas nas fezes

1. Rótulos e pré-pesar os tubos de microcentrífuga para ser utilizado para a recolha de fezes.
2. Trabalhando rapidamente depois de recuperar de uma gaiola de ratos, coloque cada rato em um copo de plástico de 500 ml. Normalmente, os ratos vão expulsar 1-4 pelotas de fezes dentro de 5 min.
3. É um fórceps estéril para transferir as fezes para tubos adequadamente etiquetados.
4. Pesar cada tubo e calcular o peso das fezes, através da subtracção do peso do tubo vazio. Pesos típicos para pastilhas fecais variar 10-30 mg.
5. Adicionar PBS em cada tubo (200 mg μl/30 fezes) e use um palito estéril para esmagar as pelotas fecais.
6. Vortex cada tubo por 30 segundos, em seguida, preparar diluições seriadas e placa em BHI / L+ G ágar. Contar o número de colônias e calcular UFC / mg fezes.

5. Processamento de tecidos intestinais infectados

1. Eutanásia dos ratos, colher assepticamente o estômago e os intestinos de cada rato como um único tecido e recolher em vazios milímetros pratos de Petri 100.
2. Separe o intestino delgado, ceco e cólon e coloque em pratos separados 60 milímetros armazenados no gelo. O intestino delgado pode ser ainda dividido pelo comprimento em três partes iguais de aproximação do duodeno, jejuno e íleo, para facilitar a remoção do conteúdo luminal. Os terços do tecido pode, então, ser processadas em conjunto (por CFU por todo intestino delgado) ou separadamente. Tecidos molhados com ~ 0,5 ml PBS estéril para manter flexível e evitar as lágrimas durante o manuseio.
3. Encha uma seringa de 10 ml com 8 ml PBS estéril e anexar uma agulha de 25 g. Use uma pinça estéreis para espremer o conteúdo luminal em um copo de resíduos (ou um tubo estéril de 50 ml, se recolher as bactérias luminais). Gripesh 4 ml de PBS através de uma das extremidades do tecido, o uso da pinça para espremer o conteúdo, e depois virar o tecido e repetir na outra extremidade.
4. Para quantificar o número de Listeria no conteúdo luminal, centrifugar os rubores reunidos durante 20 minutos a 12.000 xg, a suspender o sedimento em 0,5 - 1,0 ml de água estéril.
5. Para quantificar o número total de quantidade de células associada Listeria, abra cada tecido lavado cortando longitudinalmente com lâmina de bisturi estéril e, em seguida, fazer vários cortes laterais para cortar o tecido em fragmentos menores Nota:. Este passo é essencial para garantir que o tecido intestinal não envolver a lâmina homogeneizador. Transferir as peças intestinais para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 2 ml de água estéril.
6. Esterilizar um homogeneizador de tecidos (Fisher Power Gen 1000), colocando a sonda em etanol a 70% a 60% de potência durante 30 segundos. Espere por etanol para ar seco, ou um processo em água estéril durante 10 segundos. Homogeneizar cada tissue por 1 min. Repetir o tratamento com água estéril entre cada uma das amostras, e utilizar etanol a 70% entre os grupos de amostra.
7. Preparar diluições em série de cada amostra com água estéril e placa BHI / L + L de agar.

6. Tratamento dos infectados linfonodos mesentéricos

1. Gânglios linfáticos colheita assepticamente, coloque em uma estéril 60 milímetros prato no gelo, e usar uma pinça estéril para remover toda a gordura em anexo. Espere encontrar 3-6 nós por mouse.
2. Prepare telas de malha de arame, cortando 1,5-2 polegadas pedaços quadrados de aço inoxidável # 80 mesh. Faça um pequeno corte em cada esquina, e dobre os quatro lados, criando uma cama levantada. Mergulhe em etanol 95% e, em seguida, chama para esterilizar, e coloque em um 60 milímetros placa de Petri contendo 0,75 ml de água estéril. Após cada utilização, as telas podem ser reciclados por imersão em etanol a 70% durante 20 min, esfregando com uma escova para remover tecidos embebidos, ebulição durante 20-30 min em NaOH 2N, e em seguida a lavagem extensiva com água.
3. Usar o êmboloa partir de uma estéril seringa de 3 ml para triturar os nós através da tela da malha. Certifique-se de empurrar para baixo na tela para o fundo do prato assim que faz o contato com a água no prato.
4. Passe 0,75 ml de água estéril através da tela e, em seguida, pipeta cima e para baixo várias vezes para lavar a tela. Transferência de suspensão de células para um tubo de microcentrífuga.
5. Vortex de cada amostra vigorosamente durante 30 segundos para lisar as células. Preparar diluições em série e placa em ambos BHI / L + G agar.

7. Processamento de baço infectado, fígados, e vesícula

1. Segure baço com pinça estéril e libertar, fazendo dois cortes, um em cada extremidade. Colocar num tubo de 15 ml contendo 2,5 ml de água estéril. (Nota: os tubos com fundo redondo pode ser mais fácil de usar com o homogeneizador).
2. Localize a vesícula biliar (um amarelo pequeno saco cheio de líquido ligado ao fígado) e recorte cuidadosamente com tesoura esterilizada para separar de fígado sem estourar. Transfer para um tubo de microcentrífuga contendo 1 ml de água estéril.
3. Remover assepticamente o fígado, certificando-se para remover todos os lóbulos, e transferir para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 2,5 ml de água estéril.
4. Homogeneizar os baços e fígados como descrito acima durante 30 segundos em 60% de energia. Bexigas Forgall, utilizar tesouras estéreis para rasgar no tubo de microcentrífuga, e depois vigorosamente vórtice durante 30 seg.
5. Preparar diluições em série e as placas de cada amostra em cada BHI ou BHI / L + L de agar.

8. Processamento de cérebros infectados

1. Trabalhando a partir do lado dorsal do rato, cortar a pele e o tecido de cima do pescoço, e através de ambos os ouvidos com um ângulo de 45 °. Use uma pinça estéril para descolar a tampa em forma de U de pele puxando para o nariz e expor o crânio e ossos faciais.
2. Imobilizar o crânio, segurando a crista óssea entre os olhos com uma pinça, e utilize uma tesoura para fazer cortes superficiais através dos bordos laterais do crânio. Sercuidado para cortar apenas o osso e não o tecido cerebral. Em seguida, cortar a crista óssea entre os olhos. Use uma pinça para segurar a parte superior do crânio e puxar para trás (na direcção do pescoço) para expor o cérebro.
3. Levante cuidadosamente o cérebro de sua cavidade usando uma pinça estéril e coloque em um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 1,5 ml de água estéril.
4. Homogeneizar durante 20 segundos em 60% de potência como acima descrito. Preparar diluições em série e placa em ambos BHI ou BHI / L + G agar.

9. Procedimento Suplementar: Fracionamento de tecidos intestinais

9.1 Isolamento de bactérias na fração Muco

1. Para cada tecido intestinal, preparar 3 tubos contendo 3 mL de N-acetilcisteína, 6 mM (NAC; Sigma # A-9165).
2. Coloque a corada e cortado longitudinalmente do tecido no primeiro tubo para 1-2 min, agitando vigorosamente a cada 20-30 segundos. Utilizando uma pinça estéril, pegar o tecido e aperte suavemente contra a lateral do tubo para remover o excesso de liquid.
3. Repetir passo 9.1.2 duas vezes mais, usando os tubos restantes NAC. Remover o tecido intestinal e reserve para posterior processamento.
4. Pool de NAC lava (total de 9 mL), e centrifuga-se durante 20 min a 12.000 x g.
5. Ressuspender o sedimento em água estéril, vortex durante 30 seg, e preparar diluições em série em placas de BHI / L + G.

9.2 Isolamento de bactérias no celular (CE) Fração epitelial

1. Corte cada tecido em pequenos pedaços com uma tesoura estéreis e colocar num tubo de 50 ml contendo 5 ml de meio RPMI (Invitrogen # 21870) suplementado com 5% de FBS (RP-5), EDTA 5 mM e DTT 1 mM. Incubar com agitação a 37 ° C durante 20 min.
2. Transferir as peças intestinais para um tubo fresco contendo 5 ml RP5/EDTA/DTT e incubar com agitação a 37 ° C durante 20 min. Salvar os meios de comunicação a partir do primeiro tubo e reserve a 37 ° C. Repetir este processo mais uma vez para um total de três incubações de 20 minutos na RP5/EDTA/DTT. Se passar para a lâmina própria isopasso mento, transfira os pedaços restantes intestinais em vazio tubo de 50 ml.
3. Combina-se as três lavagens RP5/EDTA/DTT (volume total de 15 ml) e de centrifugação a baixa velocidade (1200 xg) para sedimentar as células.
4. Para quantificar as bactérias extracelulares, recolhe-se o sobrenadante e centrifuga-se durante 20 min a 12.000 x g. Ressuspender o sedimento em 0,5 - 1,0 ml de água estéril e diluições em série em placas de BHI / L + L de agar.
5. Para enumerar as bactérias intracelulares, ressuspender o sedimento em 5 ml de CE de RP-5, contendo 25 ug / ml de gentamicina. Incubar a única suspensão celular durante 30 min a 37 ° C, mais de 7% de CO ₂ para matar qualquer remanescente L. extracelular monocytogenes. Lave as células duas vezes em PBS, suspensão em 0,5 ml de água estéril, e de vórtice durante 30 segundos para lisar as células. Preparar diluições em série em água e um prato de BHI / L + G.
   Nota: As células recolhidas nesta etapa também conterá células de placas de Peyer subjacente. Se desejar, o Peyer visível éRemendos pode ser removido dos tecidos intestinais antes da lavagem e cortando longitudinalmente.

9.3 Isolamento de bactérias na lâmina própria (LP) Fração

1. Lavar o excesso de DTT / EDTA a partir das peças intestinais pela adição de 25 ml de PBS estéril com o tubo. Agite vigorosamente, transferir para um novo tubo e repetir duas vezes.
2. Transferir as peças intestinais para um tubo de 50 ml, contendo 4 ml de solução de digestão consistindo em RP-5 e suplementado com 1 mg / mL de colagenase tipo IV e 40 ug / ml de ADNase I. Incubar agitação a 37 ° C durante 40 min.
3. Transferir as peças não digeridas dentro de um tubo fresco contendo 4 ml de solução de digestão e repetir uma vez ou duas vezes até que as peças de tecido são completamente digerido. Conservar a cada uma das soluções de digestão, que contêm as células LP libertadas, a 37 ° C.
4. Centrifugar as soluções reunidas de digestão a baixa velocidade (1200 xg) para sedimentar as células. Processa-se o sobrenadante e sedimento de células separado como described acima para enumerar bactérias extracelulares e intracelulares, respectivamente.

Resultados

L. monocytogenes colónias será visível em placas de L + BHI / L, após 36-48 horas de incubação a 37 ° C. As colónias têm, em forma de cúpula aparência branca suave e cremosa (Figura 1A). O crescimento será inibido durante a maior parte da microbiota intestinal, mas é comum ver algumas colónias que não são L. monocytogenes, particularmente quando plaqueamento intestino delgado ou cólon directamente sem diluição significativa (Figura 1B). Colónias sus...

Discussão

Camundongos isogênicos não são uniformemente receptivo a alimentação em todos os momentos do dia, e sua vontade de comer o pão contaminado vai depender tanto da cepa e da idade dos camundongos ^17. Em nossa experiência, 6-9 semanas de idade camundongos B6 são receptivos a alimentar a qualquer hora do dia, mas camundongos BALB não vai comer de forma consistente o pedaço de pão a menos que seja oferecido durante o seu ciclo de escuro. O ciclo de luz da sala utilizada para abrigar os animais podem ser ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Heart Infusion Agar	Difco	BD-241830
Lithium chloride	Sigma	L9650
Glycine	Omnipur	4840
EDTA	Gibco	15575-038
DTT	Sigma	D5545
Collagenase, type IV	Worthington	LS004089
DNAse I	Worthington	LS002007
Diff-Quik	Dade-Behring	B4132-1A
PowerGen 1000 homogenizer	Fisher	14-261-06
stainless steel type 304 mesh #80	Small Parts, Inc.	CX-0080-C
Cytospin	Statspin	M801-22