协议的射频评估与互动金纳米粒子和生物系统的非侵入性癌症热疗治疗

摘要

我们描述了用于研究的13.56MHz的射频（RF）的相互作用的协议电领域，在这两种非生物和生物系统（ 体外 / 体内 ）纳米金胶体。这些相互作​​用正在研究用于癌症治疗的应用。

摘要

癌症疗法的毒性较小和侵入比现有的同行是非常可取的。使用射频电领域的深入渗透到体内，引起毒性最小的，目前正在研究作为非侵入性癌症治疗的可行手段。可以预想到的RF能量与内在化纳米粒子（纳米粒子）的相互作用可以解放热，然后可以引起细胞的过热（热疗），最终结束于细胞坏死。

在非生物系统的情况下，我们提出有关量化由高浓度的NP胶体释放的热​​量详细的协议。对于生物系统，在体外实验的情况下，我们描述了必须坚持，才能有效地揭露癌细胞射频能量而不散装媒体加热工件显著模糊数据的技术和条件。最后，我们给出了一个详细的方法f或体内小鼠模型异位肝癌肿瘤。

引言

射频能量的生物组织（由于其固有的介电常数）的吸收导致在升高组织温度作为时间的函数，这最终导致通过热疗细胞死亡。据推测，癌症热疗可通过使用靶向的纳米材料内化的癌细胞内，并作为射频热换能器，使相邻的健康，正常细胞完整的优化。有几份报告已经表明，各种纳米粒子可作为有效的射频热源，其帮助癌症坏死^1-4。

在这些方面，金粒子（金纳米粒子^）3-5，碳纳米管^1，和量子点^6,7已经表现出令人兴奋的特性在体外和体内射频实验时使用。虽然当暴露在射频领域的这些纳米粒子的加热机制的确切性质仍存在争议，一系列用金纳米粒子基础实验寄予了很大意义上都NP大小和聚集状态。它表明，直径<10nm的金纳米粒子仅当暴露于射频场⁸将加热。此外，当金纳米粒子聚集该加热机构被显著衰减。这种聚合条件也有效的体外模型放置在endolysomal细胞车厢内优化金纳米粒子的胶体稳定性的有效射频治疗⁴中的重要性。然而，用于收集和评估该数据的技术和实验原理可能会产生问题，特别是在从NP胶体验证射频热访问的情况下。

一些报告显示，背景离子悬浮液，该纳米颗粒被悬浮在焦耳加热可以是射频产热的主要来源，而不是粒子本身^9-12。尽管我们最近的一篇论文⁸已经验证吨他使​​用RF相互作用从直径小于10纳米的金纳米粒子产生热量，我们的目标是在这篇文章中详细描述了这些协议。

我们还证明了协议和评估金纳米粒子作为体外和体内实验为肝癌模型温热热剂中均有效性所需要的技术。虽然我们主要集中于柠檬酸封端的纳米金胶体简单，相同的技术可以被应用到其他金纳米粒子的杂交如抗体和化疗结合的复合物。通过遵循这些原则，实验者应该希望能够快速评估对于任何纳米材料是一种有效的射频感应热温热剂的潜力。

研究方案

一个完整的实验概述如图1所示。

进一步的细节被描述在下面的步骤1月3日。

1。 NP胶体评估射频加热:金纳米粒子为例。

1. 在一般情况下，对于每个样品NP正在研究中，首先通过离心过滤洗涤样品数次，用去离子（DI）水，以去除背景离子和污染物。所有离子和污染物将被从什么时候被洗出液也有类似的射频加热速率（HRS）为去离子水在金纳米粒子悬浮液中除去。此纯化过程还允许粒子以获得更高的浓度。值得注意的是，尽管在本例中使用金纳米粒子，基本原理可以应用到其它的NP材料。
2. 作为一个例子，净​​化的500ml瓶的直径为5nm市售的金纳米粒子，然后使他们受到电连接的一个13.56MHz的射频场ELD强度90千伏/米。
   1. 拿〜125毫升从六个50 kDa的离心过滤管之间的股票金纳米粒子溶液和分裂。离心机在3000转每分钟。 2分钟5秒。更多原液过滤除去缓冲和填充的过滤器。重复，直到所有500毫升已被过滤。
   2. 更换过滤缓冲液DI水相似的体积和重复约8倍（或直到滤波后的RF缓冲器的HR等同于DI水中）。注意，紫外 - 可见分析也可以用来监视污染物的吸收峰。一旦缓冲区污染物已完全清除，吸管约0.5毫升去离子水到每个过滤器和通过反复吹打重悬金纳米粒子。这应该完全从过滤器中删除金纳米粒子，并允许充分重悬。结合所有六个悬浮成一个15毫升的Eppendorf管中。
   3. 一旦金纳米粒子被提纯和浓缩，用ICP-OES和/或ICP-MS，UV-vis和Zeta电位上concentratio数据分析样本n和NP稳定，分别为。 SEM和/或TEM分析，也可用于获得形态学数据。对这些技术的详细的样品制备可以在文献⁴中找到。
3. 通过在先前的研究中⁸所述的Kanzius射频系统或该系统的派生，放置一个1.3毫升圆柱形石英比色皿，使空气中的射频电场（无样品存在）将〜90千伏/米的反应杯内。对于一个标准的盐水样品（0.9％NaCl）中的电场将减少到〜1.1千伏/米。这些是用来允许在不同系统之间进行的比较的近似条件。
   1. 吸移管130的纯化的金纳米粒子胶体到石英比色皿1000毫克/升样品的溶液和该引入到RF场。这可以通过使用一个定制的聚四氟乙烯样品架来完成。样品暴露于RF场为一个周期120秒或直至样品达到70℃，以防止电弧或快速沸腾。钙利用红外相机及相关软件pture热成像数据（以及控制区）。重复此步骤三次。
   2. 通过另一个50 kDa的离心过滤器过滤样品，从去离子水缓冲液中提取的金纳米粒子。缓冲区重新暴露于RF场，再次三次。在金纳米粒子胶体和背景DI水缓冲器之间的HR的差异决定了HR由于金纳米粒子本身。预计取得的HR〜0.3°C /秒和0.05℃/秒，得到〜0.25℃/秒的金纳米粒子相关的人力资源。重悬从过滤器的剩余金纳米粒子130毫升水中的体外/体内实验。

2。纳米粒子辅助射频热疗诱导: 体外研究

1. 这些体外研究可以应用于任何类型的形成2D单层癌细胞类型。在这个实验中使用派生的Hep3B细胞肝癌。
   1. 板〜50,000 CELLS在前面3口井12孔板用1毫升生长培养基中。重复此6倍（使用三个板块为NP的研究和三大板块作为对照）。孵化在37.5℃，引入纳米颗粒前24小时。使用生物安全柜紫外线灯照射5分钟消毒粒子第一。
   2. 在每孔中介绍加入0.1ml 1000 mg / L的金纳米粒子的溶液，留下另外24小时。加入0.1毫升的水成三个控制细胞板的每个孔中，并放置24小时。
   3. 后24小时已经过去了，吸出细胞培养基，用PBS洗涤以除去任何表面结合的金纳米粒子。更换细胞培养基。细胞现在已经准备好为RF暴露。
2. 将射频场中的每个12孔细胞组。等到细胞已经冷却到31°C。打开RF发生器和暴露为3.5分钟。细胞培养基的最终温度为〜37℃。关闭RF场。取下电池，并将其放置在孵化器进行分析前24小时。
   1. 从孵化器和吸细胞介质中删除单元格。加1.6毫升细胞培养基到每个孔中，以及在0.4毫升MTT试剂。孵育细胞4小时。吸媒体和替换用2毫升二甲基亚砜（DMSO）的。将电池板的长凳上摇臂，离开10分钟，使DMSO溶解的MTT试剂。最后，用酶标仪如SPECTROstar纳米板读取器移液管加入100μl每孔加入到96孔板中并光学读取以及在570nm处。

3。纳米粒子辅助的射频诱导热疗: 体内研究

1. 这些体内研究可以应用于任何类型的癌症，形成实体瘤中原位或异位小鼠模型。本实验采用的Hep3B肝癌细胞在异位瘤BALB-C裸鼠模型。
2. 注:所有体内实验均符合所有相关指引，法规和监管机构执行。此外，得克萨斯大学MD安德森癌症中心实验动物管理和使用委员会（IACUC）的指导和批准下进行演示的协议。
   1. 生长细胞的适当数量（〜100 k）在第一个组织培养瓶用适当的生长培养基中。孵育在37℃的培养箱中5％CO ₂的细胞培养物的持续时间。
   2. 处理细胞，用胰蛋白酶（从烧瓶中分离），并产生2百万个细胞每25微升的溶液中。添加基质胶的等量（冰），调匀，以准备最后的注射液。注入此溶液到鼠标的背面所需的位置，然后等待适当的时间量对肿瘤生长到所需的大小（2-4周对大多数细胞）。 RF暴露之前，BALB-c裸鼠应承担固体异位瘤0.5-1厘米直径。
3. 1. 制备的小鼠中使用（在这种情况下的BALB-C裸鼠）由ANAEsthetizing他们用氯胺酮和甲苯噻嗪通过IP注射的溶液。当小鼠入睡，让他们在一个温度控制腔在37°C 20只小鼠中总将是需要的，所有的轴承同样大小的肿瘤。十只小鼠将与结合和未经金纳米粒子用于（后者仅PBS注射）而剩余的10只小鼠将射频曝光和未射频暴露的对照组之间进行分割:两组无金纳米粒子射入。
   2. 一旦正确麻醉，注入纳米金直接用1毫升注射器用27号针头的肿瘤。在金纳米粒子的溶液应该是在200毫克/升的金浓度在0.1ml PBS中。注射后，用棉签手术吸收血液和擦拭注射部位用酒精擦拭。
   3. 然后挂接鼠标放在射频发生器的接收头进行处理。鼠标必须定位，以使所述肿瘤是最接近于传输头。屏蔽并非要处理的区域，以及敏感略去，如眼睛，耳朵，脚趾和地区，铜带。可以肯定的是，这样没有电荷积聚时铜带适当接触接地平面。另外，在曝光区域必须具有至少1cm大于所需治疗部位的大小的间隙。
   4. 位置红外热成像摄像机，使肿瘤及其治疗区域是可见的。打开射频5分钟。记录所产生的温度曲线。如果治疗达到立即温度高于42℃停止治疗。
4. 1. 经过RF暴露恢复小鼠从麻醉中一个温暖的室内，直到他们是有意识的。
   2. 重复实验，相同的小鼠48小时后（步骤3.3.1 - 3.4.1）。
   3. 实验结束后，安乐死小鼠按照机构的协议和程序。记录肿瘤的重量。组织学分析解决使用福尔马林的肿瘤和它们嵌入在石蜡。肿瘤切片通常机智染色ħ苏木精伊红和相关的衡量治疗效果， 如 Ki-67的目标，裂解的caspase-3 等 。

结果

1。评估的NP胶体的射频加热:纳米金作为例子。

下一节1.1后 - 1.2.3期望有5 nm和10 nm的金纳米粒子的直径高度集中，稳定，纯净的解决方案。从500毫升如购买的原液，期望获得至少为4毫升溶液在1000毫克/升的浓度该金纳米粒子，并在此浓度的背景DI水缓冲溶液之间的HR的差值应为〜0.25℃/秒和0.1℃/秒为5 nm和10 nm的金纳米粒子，分别为显示在图2。

2。?...

讨论

这些协议允许实验者充分分析的程度的纳米材料（在这种情况下金纳米粒子）可以增加射频诱导的高热用于癌症治疗。第一个协议，专门处理与分析产热量从高度集中及纯化的金纳米粒子样品。尽管其它研究小组报道的产热主要从该金纳米粒子悬浮于而不是金纳米粒子本身^9-11的缓冲器，它们的射频系统中使用的较低的金纳米粒子的浓度，直径> 10nm时，以及具有较低的RF工作功率电电场?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
500 ml gold nanoparticles (5 nm)	Ted Pella, INC	15702-5
Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa)	Millipore	UFC805024/UFC910096	(4 ml and 15 ml volumes)
MEM X1 Cell Culture Media	Cellgro	10-101-CV	(add extra nutrients as necessary)
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135-500 ml
Copper Tape	Ted Pella	16072
Equipment
Kanzius RF System (13.56 MHZ)	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
IR Camera	FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)	Contact FLIR
1.3 ml Quartz Cuvette	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Teflon Sample holder with Rotary Stage	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano Microplate reader	BGM Labtech
UV-Vis spectrometer	Applied Nanofluorescence, Houston, TX)	NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S	PerkinElmer	Optima 4300 DV
Zetasizer	Malvern	Zen 3600 Zetasizer