Protocolos para Avaliação de radiofreqüência Interações com Nanopartículas de Ouro e Sistemas biológicos para terapia não-invasiva Câncer Hipertermia

Resumo

Descrevemos os protocolos utilizados para investigar as interações de 13,56 MHz de radiofreqüência (RF) elétricos campos com colóides de nanopartículas de ouro em ambos os sistemas não-biológicos e biológicos (in vitro / in vivo). Essas interações estão sendo investigados para aplicações na terapia do câncer.

Resumo

Terapias do cancro, que são menos tóxicos e invasivo do que os seus homólogos existentes são altamente desejáveis. O uso de RF-campos elétricos que penetram profundamente no corpo, causando toxicidade mínima, estão actualmente a ser estudada como um meio viável de tratamento do câncer não-invasivo. Prevê-se que as interações de energia de RF com nanopartículas internalizadas (PN) pode libertar calor que pode causar superaquecimento (hipertermia) da célula, em última análise, que termina em necrose celular.

No caso de sistemas não-biológicos, apresentamos protocolos detalhados relativos a quantificação do calor liberado por colóides NP altamente concentrados. Para os sistemas biológicos, no caso de experimentos in vitro, descrevemos as técnicas e as condições que devem ser observadas, a fim de expor eficazmente as células cancerosas à energia de RF, sem mídia artefatos de aquecimento a granel obscurecendo significativamente os dados. Finalmente, damos uma metodologia detalhada fou em modelos in vivo de mouse com tumores de câncer hepático ectópica.

Introdução

A absorção de energia de RF por um tecido biológico (devido à sua permitividade eléctrica inerente) resulta em temperaturas elevadas do tecido em função do tempo, o que eventualmente leva a morte celular por hipertermia. Supõe-se que a hipertermia pode ser optimizado para o cancro através da utilização de nanomateriais segmentados que internalizam dentro da célula cancerosa e actuar como transdutores de RF-térmicos, deixando as células normais vizinhas, saudáveis ​​intactas. Vários relatos já mostraram que uma variedade de NPs podem atuar como fontes de calor RF eficaz que ajuda na necrose câncer ^1-4.

Nestes aspectos, NPs de ouro (AuNPs) ^3-5, os nanotubos de carbono ^1, e pontos quânticos ^{6, 7} exibiram características emocionantes, quando utilizado em estudos in vitro e in vivo em experimentos de RF. Embora a natureza exata do mecanismo de aquecimento dessas NPs quando expostos a um campo de RF ainda está sendo debatido, uma série deexperiências fundamentais usando AuNPs tem colocado grande importância tanto tamanho NP e os estados de agregação. Foi demonstrado que apenas AuNPs com diâmetros <10 nm aquecerá quando expostos a um campo de ^RF-8. Além disso, este mecanismo de aquecimento é atenuada significativamente quando os AuNPs são agregados. Esta condição agregação também foi validado dentro de modelos in vitro que colocaram importância sobre otimização AUNP estabilidade coloidal dentro de compartimentos intracelulares endolysomal para a terapia eficaz RF ^4. No entanto, as técnicas e os princípios experimentais utilizados para coletar e avaliar esses dados pode ser problemático, especialmente no caso de validar perfis calor RF de colóides NP.

Vários estudos têm mostrado que o aquecimento Joule da suspensão iônica fundo que os NPs são suspensas pode ser a principal fonte de produção de calor de RF e não os próprios ^9-12 PN. Embora o nosso trabalho recente ⁸ validou tA utilização da RF interações na geração de calor a partir AuNPs de diâmetro inferior a 10 nm, pretendemos descrever esses protocolos com mais detalhes ao longo deste artigo.

Nós também demonstramos os protocolos e as técnicas necessárias para avaliar a eficácia de AuNPs como agentes térmicos hipertermia, tanto in vitro e in vivo para os modelos de câncer de fígado. Embora nos concentrar-se principalmente no colóides simples de AuNPs cobertas de citrato, as mesmas técnicas podem ser aplicadas a outros híbridos AUNP tais como complexos anticorpo-e quimioterapia conjugado. Ao aderir a esses princípios o experimentalista deve esperamos ser capazes de avaliar rapidamente o potencial de qualquer nanomaterial para ser um agente hyperthermic térmica induzida pela RF eficaz.

Protocolo

Uma visão geral experimental completo está representado na Figura 1.

Mais detalhes são descritos nas etapas 1-3 abaixo.

1. Avaliando Aquecimento RF de NP Colóides: AuNPs como exemplo

1. Em geral, para cada amostra a ser investigada NP, primeiro lavar várias vezes as amostras por meio de um filtro de centrifugação com água desionizada (DI) de água para remover os iões de fundo e contaminantes. Todos os iões e contaminantes terá sido removida da suspensão AUNP quando o líquido a ser lavado para fora tem taxas semelhantes de aquecimento RF (HR) como água DI. Este processo de purificação permite também que para as concentrações mais elevadas de PN a ser obtidos. Vale a pena notar que, embora utilizando AuNPs neste exemplo, os princípios fundamentais podem ser aplicados a outros materiais NP.
2. Como um exemplo, purificar um frasco de 500 ml de AuNPs disponíveis comercialmente de diâmetro de 5 nm e, em seguida, submetê-los a um campo de RF de 13,56 MHz de eletro-field força de 90 kV / m.
   1. Tome ~ 125 ml da solução estoque AUNP e divisão entre seis a 50 kDa tubos de filtro de centrífuga. Centrifugar a 3.000 rpm. durante 2 min 5 seg. Remover filtros de buffer e de recarga filtrados com mais solução estoque. Repita até que todos os 500 ml foi filtrada.
   2. Substituir o tampão filtrado com um volume similar de água DI e repetir cerca de 8 vezes (ou até que as HRs RF tampão filtrados são equivalentes a água Dl). Nota, a análise por UV-Vis, também pode ser utilizado para monitorar os picos de absorção de contaminantes. Uma vez que os contaminantes tampão ter sido totalmente removido, pipeta de aproximadamente 0,5 ml de água Dl para cada filtro e ressuspender as AuNPs por pipetagem repetida. Isto deve remover completamente os AuNPs do filtro e para permitir a ressuspensão completa. Misture todos os seis suspensões em um tubo de 15 ml Eppendorf.
   3. Uma vez que os AuNPs foram purificadas e concentradas, analisar a amostra utilizando ICP-OES e / ou ICP-MS, UV-vis e potencial Zeta de dados sobre concentration e estabilidade NP, respectivamente. SEM e / ou análise de TEM, também pode ser utilizado para obter os dados morfológicos. A preparação da amostra detalhada para estas técnicas podem ser encontrados na literatura ^4.
3. Usando o sistema de Kanzius RF descrito em estudos anteriores ^8, ou derivações deste sistema, coloque um 1,3 ml cilíndrico quartzo tina de modo que o campo elétrico RF no ar (sem amostra presente) seria a 90 kV / m no interior da cuba. Para uma amostra de soro fisiológico normal (0,9% NaCl) a-campo eléctrico será reduzida para ~ 1,1 kV / m. Estas são as condições aproximadas utilizadas para permitir que sejam feitas comparações entre diferentes sistemas.
   1. Pipetar 1,3 ml de uma amostra de 1000 mg / l de colóide AUNP purificada na cuvete de quartzo e introduzi-la em a-campo RF. Isto pode ser feito por meio de um suporte de amostra de Teflon construído sob encomenda. Expor amostra para o campo de RF durante um período de 120 segundos ou até a amostra atingir 70 ° C para evitar a formação de arco eléctrico ou de ebulição rápida. Capture os dados de imagens térmicas (bem como as áreas de controle) usando uma câmera IR e software associado. Repita este procedimento três vezes.
   2. Filtrar a amostra através de um outro filtro de centrífuga de 50 kDa para extrair os AuNPs do tampão de água DI. Re-expor o tampão para o campo de RF, novamente três vezes. A diferença de horas entre o colóide AUNP eo buffer de água DI fundo determina o HR devido aos próprios AuNPs. Esperar obter horas de ~ 0,3 ° C / seg e 0,05 ° C / seg a dar um AUNP dependente de HR de ~ 0,25 ° C / seg. Volte a suspender as AuNPs restantes do filtro em 1,3 ml de água para experimentos in vitro in vivo /.

2. Hipertermia induzida pela RF assistida por Nanopartículas: Estudos in vitro

1. Estes estudos in vitro, pode ser aplicado a qualquer tipo de tipo de célula cancerosa que formam monocamadas 2D. Neste experimento usar carcinoma hepatocelular humano derivado de células Hep3B.
   1. Placa ~ 50.000 cells nas três dianteiros cavidades de uma placa de 12 poços com 1 ml de meio de crescimento. Repita este 6 vezes (usar três placas para estudos NP e três placas como controles). Incubar a 37,5 ° C por 24 horas antes de introduzir os NPs. Esterilizar PN primeiro usando BioSafety Gabinete exposição UV-luz por 5 min.
   2. Em cada poço introduzir 0,1 ml de uma solução 1,000 mg / L AUNP e deixar durante mais 24 horas. Adicionar 0,1 ml de água em cada poço das placas de três células de controlo e também deixar durante 24 horas.
   3. Após 24 horas ter passado, aspirar os meios de comunicação das células e lavagem com PBS para remover quaisquer AuNPs ligadas à superfície. Substitua a mídia celular. As células estão prontas para a exposição RF.
2. Coloque cada pacote de células de 12 poços dentro do campo de RF. Espere até que as células tenham arrefecido a 31 ° C. Ligue o gerador de RF e expor para 3,5 min. A temperatura final do meio celular será ~ 37 ° C. Desligue o campo de RF. Remover as células e colocá-los em uma incubadora por 24 horas antes da análise.
   1. Retirar células da incubadora e media célula aspirado. Adicionar 1,6 ml de meio de células de cada poço, assim, de 0,4 ml de reagente MTT. Incubar as células durante 4 horas. Aspirar a mídia e substituir com 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Colocar as placas da célula num agitador de bancada e deixar durante 10 minutos para permitir que o DMSO, para solubilizar os reagentes MTT. Finalmente, uma pipeta de 100 uL de cada poço para uma placa de 96 poços e opticamente lido do poço a 570 nm utilizando um leitor de placas, tais como o leitor de placas SPECTROstar Nano.

3. Hipertermia induzida pela RF assistida por Nanopartículas: estudos in vivo

1. Estes estudos in vivo, pode ser aplicado a qualquer tipo de cancro que formam tumores sólidos, em um modelo murino ortotópico ou ectópica. Este experimento utiliza células de câncer de fígado Hep3B em um modelo de camundongo ectópica tumor BALB-C Nude.
2. Nota: todos os experimentos in vivo são executadas em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras. Além disso, o protocolo que está sendo demonstrada foi realizada sob a orientação e aprovação do Animal Care and Use Committee University of Texas MD Anderson Cancer Centers Institucional (IACUC).
   1. Crescer um número apropriado de células (~ 100 k) em um balão de cultura de tecidos com meio de crescimento adequado. Incubar numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante o período de cultura de células.
   2. Tratar as células com tripsina (para separar do balão) e produzir uma solução de 2 milhões de células para cada 25 ul. Adicionar uma quantidade igual de Matrigel (no gelo) e misture bem para preparar a solução de injeção final. Injectar esta solução para a posição desejada na parte traseira do rato e esperar uma quantidade apropriada de tempo para os tumores crescerem até ao tamanho desejado (2-4 semanas para a maioria das células). Antes da exposição RF, BALB-C camundongos nus deve ter tumores sólidos ectópica 0,5-1 cm de diâmetro.
3. 1. Preparar os ratos para ser utilizado (neste caso de BALB-C ratinhos nu) por anaesthetizing los com uma solução de cetamina e xilazina por injecção IP. Enquanto os ratos estão caindo no sono, mantê-los em uma câmara com temperatura controlada a 37 ° C. Serão necessários 20 camundongos no total, todos os tumores de tamanho semelhante de rolamento. Dez ratos será usado em conjunto com e sem AuNPs (sendo este último apenas injeções de PBS), enquanto os restantes 10 ratos serão divididos entre os controles expostos à RF não RF-expostos e ambos os grupos: sem injeções AUNP.
   2. Uma vez devidamente anestesiados, injetar os AuNPs diretamente no tumor, utilizando uma seringa de 1 cc com uma agulha G 27. A solução AUNP deve estar a uma concentração de 200 mg de Au / L em 0,1 mL de PBS. Após a injeção, use um cotonete cirúrgico para absorver o sangue e limpar o local da injecção com um algodão embebido em álcool.
   3. Em seguida, montar o mouse para ser tratada na cabeça de recepção do gerador de RF. O rato tem de ser posicionado de modo a que o tumor é o mais próximo da cabeça de transmissão. Proteja as áreas que não estão a ser tratados, bem como a sensibilidadetiva áreas como olhos, ouvidos, mãos e pés, com fita de cobre. Certifique-se de que a fita de cobre é apropriadamente entrar em contato com o plano de terra para que não ocorra o acúmulo de carga. Além disso, a área de exposição tem de ter um espaço de pelo menos 1 cm maior do que a dimensão do local de tratamento desejado.
   4. Posição IV câmara térmica de modo a que o tumor e a área de tratamento são visíveis. Ligue RF por 5 min. Registre a curva da temperatura resultante. Se a terapia atinge temperaturas superiores a 42 ° C de tratamento de parar imediatamente.
4. 1. Após a exposição RF recuperar os ratos da anestesia em uma câmara quente até que eles são conscientes.
   2. Repita a experiência com o mesmo camundongos 48 horas mais tarde (etapas 3.3.1 - 3.4.1).
   3. Após a experiência, a eutanásia dos ratos de acordo com os protocolos e procedimentos institucionais. Registar o peso do tumor. Para a análise histológica corrigir os tumores usando formalina e incorporá-los em parafina. Seções tumorais são normalmente manchado sagacidadeh hematoxilina e eosina e para alvos relevantes para medir a eficácia terapêutica, por exemplo, Ki-67, caspase-3, etc.

Resultados

1. Avaliando aquecimento RF de colóides NP: AuNPs como exemplo.

Depois de seguir a seção 1.1 - 1.2.3 esperamos ter uma solução estável e purificada altamente concentrado de 5 nm e 10 nm de diâmetro AuNPs. A partir dos 500 ml de solução de estoque-comprados, esperamos obter, pelo menos, 4 ml de solução, a uma concentração de 1,000 mg / L. A diferença de horas entre a AuNPs e a solução tampão de água DI fundo com esta concentração deve ser ~ 0,25 ° C / seg e 0,1 ° C / seg a ...

Discussão

Estes protocolos permitem o experimentalista completamente a analisar a medida em que os nanomateriais (neste caso AuNPs) pode aumentar a hipertermia induzida por RF para o tratamento do cancro. O primeiro protocolo trata especificamente analisando a produção de calor a partir de amostras AUNP altamente concentrada e purificada. Embora outros grupos relataram a produção de calor, principalmente a partir dos tampões que os AuNPs são suspensos e não as próprias ^9-11 AuNPs, os seus sistemas de RF utiliza...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
500 ml gold nanoparticles (5 nm)	Ted Pella, INC	15702-5
Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa)	Millipore	UFC805024/UFC910096	(4 ml and 15 ml volumes)
MEM X1 Cell Culture Media	Cellgro	10-101-CV	(add extra nutrients as necessary)
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135-500 ml
Copper Tape	Ted Pella	16072
Equipment
Kanzius RF System (13.56 MHZ)	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
IR Camera	FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)	Contact FLIR
1.3 ml Quartz Cuvette	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Teflon Sample holder with Rotary Stage	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano Microplate reader	BGM Labtech
UV-Vis spectrometer	Applied Nanofluorescence, Houston, TX)	NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S	PerkinElmer	Optima 4300 DV
Zetasizer	Malvern	Zen 3600 Zetasizer